材料和试剂

移液器吸头（美国科学，目录号：[10μl] 1011212710; [200μl] 11208710; [1,000μl] 11267710）
T-75组织培养瓶（VWR，目录号：10062860）
5 ml血清转移移液管（Corning，Falcon，目录号：357543）
10毫升血清转移移液管（康宁，猎鹰，目录号：356551）＆nbsp;
25毫升血清转移移液管（Corning，Falcon，目录号：356535）
组织培养24孔板（Sigma-Aldrich，目录号：SIAL0524）
无菌培养皿（BD，Falcon，目录号：351029）
50毫升管（Falcon，Becton Dickinson，目录号：352098）
15毫升管（Falcon，Becton Dickinson，目录号：352099）
Eppendorf管（1.6 ml，平顶）（Midwest Scientific，目录号：SS1500）
L形吊具（USA Scientific，目录号：29775500）
Burkholderia thailandensis E264
0.25％胰蛋白酶（Gibco，Life Technologies，目录号：25200056）
不含酚的RPMI-1640培养基（Life Technologies，Gibco，目录号：11835030）
热灭活FBS（胎牛血清）（ATCC，目录号：80721500）
1 M HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：7365459）
100x非必需氨基酸溶液（ATCC，目录号：302116）
75.0g / L碳酸氢钠溶液（HyClone，Thermo Scientific，目录号：SH30033.01）＆nbsp;
100x抗生素/抗真菌溶液（J R Scientific，Inc。，目录号：20004）
1x Ca 2 + / Mg 2 + -free DPBS（Gibco，Life Technologies，目录号：A12856-01）
肺泡巨噬细胞（AMs）（ATCC，目录号：CRL-2019）
20μgIFN-γ（ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.，目录号：Cyt358a）
Luria Bertani（LB）肉汤（BD，Difco，目录号：244620）
Luria Bertani琼脂（BD，BBL，目录号：212304）
绝对乙醇（200标准）（Fisher Scientific，目录号：174904）
卡那霉素（BioChemika，Fluka，目录号：42904168）
Clorox杀菌漂白剂（VWR，目录号：10028048）
Triton X-100（Sigma Chemical CO。，目录号：103H0421）
10％热灭活FBS / 1x DPBS（参见食谱）＆nbsp;
1x抗生素/抗真菌溶液（见食谱）
肺泡巨噬细胞培养基（RPMI）（见食谱）
200 U /μlIFN-γ（见食谱）
0.08％乙醇（见食谱）
250或50μg/ ml卡那霉素（见食谱）
10％Clorox漂白剂（见食谱）
0.1％Triton X-100（见食谱）

设备

P10 Pipetman（Rainin，目录号：A0602538G）
P20 Pipetman（VWR，目录号：041432480）＆nbsp;
P200 Pipetman（VWR，目录号：441454097）＆nbsp;
P1000 Pipetman（吉尔森，产品目录号：F123602）＆nbsp;
分光光度计（Eppendorf，BioPhotometer，型号：613124291）
37°C，5.5％，CO 2 水夹套孵化器（Eppendorf，New Brunswick，型号：C017051201000）＆nbsp;
生物安全柜（Forma Scientific，型号：1286）＆nbsp;
浅水浴（Bio-Rad，Sheldon Manufacturing，INC。，型号：BR122）
血细胞计数器室（Hausser Scientific，目录号：3100）
-20°C冰箱＆nbsp;
-80°C冰箱＆nbsp;
倒置光学显微镜（VanGuard，型号：002443）
高压灭菌＆NBSP;
轨道地板振动筛（New Brunswick Scientific CO。，型号：C25）
用于2 ml管的冷藏台式离心机（Lab Care America，Jouan CR3，型号：CR3i）
离心机，Sorvall传奇RT +（赛默飞世尔科技，目录号：75004377）＆nbsp;

软件

GraphPad Prism 5（GraphPad软件）

程序

注意：

在实验前将所有组织培养试剂（参见食谱）预热至37°C。
该方案在生物安全二级条件下用无菌技术进行。

生长肺泡巨噬细胞（AMs）（图1A）
1. 解冻冷冻管（1×10 6个细胞/1.0ml），将小瓶的内容物转移到15ml管中，并在1,300 （4℃）下离心3分钟。
2. 倒出上清液并将细胞沉淀重悬于1ml预热的培养基中（参见上面的注释）。
3. 将细胞重悬浮转移到T-75组织培养处理的烧瓶中。＆nbsp;
4. 将组织培养瓶在培养箱中孵育48-72小时（参见设备＃6）。
5. 在实验前每24小时更换组织培养瓶中的培养基。
6. 在用于实验组织培养板之前，允许AM在组织培养瓶中生长至70％-80％汇合。
组织培养板中的种子AMs（图1B）
1. 从T-75烧瓶中取出培养基，用5ml 1x DPBS洗涤细胞。
2. 丢弃1x DPBS清洗液。
3. 通过在37℃下加入3ml胰蛋白酶4分钟胰蛋白酶消化组织培养瓶。
4. 轻轻刮擦烧瓶底部以除去附着的细胞。
5. 搅拌烧瓶并在倒置光学显微镜下观察以确保>> 90％的细胞都脱落了。＆nbsp;
6. 通过加入6-8ml预热的培养基中和胰蛋白酶。
7. 从烧瓶中取出细胞悬浮液，转移到15ml锥形管中。
8. 将细胞在480 x g 下旋转5分钟，然后除去尽可能多的上清液。
9. 将细胞重悬于3-5 ml RPMI（预热至37°C）。
10. 取10μl细胞重悬，并与10μl台盼蓝混合。如Tachibana 等人（2016和2017）中所述，使用血细胞计数器计算细胞悬浮液的浓度。
  使用血细胞计数器计算浓度的公式：
11. 确保在显微镜下不存在过多的细胞双峰。我们建议重新分离过多的细胞聚集。＆nbsp;
12. 将细胞悬浮液稀释至RPMI中5×10 5个/ ml细胞/ ml的实际终体积。
13. 将每孔1ml RPMI细胞悬浮液等分至24孔平底板。
14. 在37°C孵育过夜，使细胞变得粘附。
用暴饮酒精剂量攻击细胞（图1C和1D）
1. 将无水乙醇（200标准）加入室温。＆nbsp;
2. 更换培养基并添加补充有乙醇的培养基，浓度为1 ml时达到0.08％v / v（参见食谱）。＆nbsp;
3. 对于阴性对照，添加不含乙醇的培养基。＆nbsp;
4. 用暴食酒精剂量攻击细胞3小时。＆nbsp;
5. 用1x DPBS洗涤细胞，用无抗生素培养基替换培养基。
  注意：用补充有乙醇的水代替孵化器水浴，浓度达到0.08％（v / v）。大气乙醇浓度相当于组织培养基中的酒精浓度，以减少蒸发。
刺激（图1E）
原代细胞：去除细胞上清液并加入含有400U / ml IFN-γ的新鲜RPMI培养基，在37℃下孵育8-12小时。对于没有400U / ml IFN-γ的其他孔的替换培养基用于“无IFN-γ”对照。
注意：在酒精攻击后和活细菌攻击前，用IFN-γ刺激肺泡巨噬细胞。不需要额外的外源性LPS刺激。
细菌制备和感染（图1F）
1. 对于每项研究，利用冷冻原种培养物（ Burkholderia spp。）并接种LB肉汤（参见食谱）并在37°C下在轨道振荡器培养箱中孵育过夜。
2. 将过夜细菌培养物1：100稀释（0.1ml至9.9ml LB肉汤中）并允许通过600nm处的光密度（OD）测量生长至对数晚期。
3. 当OD达到0.3至0.5吸光度时，通过离心（2,500 x g 5分钟）收集1 ml细菌，并重悬于1 ml无抗生素RPMI培养基中。
4. 从初步菌落形成单位（CFU）平板计数，调整体积以提供20μl中1：1 CFU的多重感染（MOI）。确定MOI（MOI =每个肺泡巨噬细胞的细菌数）并相应地改变接种物制剂。对于MOI为1，添加 B的5 x 10 5 CFU。每孔含有5×10 5个 AM细胞的thailandensis 。
  注意：添加的细菌培养物的量将取决于培养基中细菌的密度。对于该测定，使用1：1的细胞：细菌比率以允许发生初始吞噬并且进一步监测细胞内杀伤。应进行初步实验，以确定将细菌重新悬浮于无抗生素RPMI培养基中后，用于测定的OD的总CFU / 1 ml。＆nbsp;
5. 通过将组织培养板向您倾斜，同时将细菌施用到合并的培养基中，每孔感染肺泡巨噬细胞单层细胞。用移液管尖端不要打扰附着的巨噬细胞单层。对于阴性对照，每孔加入1x DPBS。
6. 将细胞培养板在250 x g 离心5分钟，以增加细胞和细菌之间的相互作用（参见设备＃16）。＆nbsp;
7. 让细胞和细菌共培养3小时。
消除细胞外细菌（图1G）
注意：与活细菌接触的培养基和仪器用70％乙醇，10％漂白剂和去离子水消毒。
1. 将上清液从组织培养板中弃去10％漂白剂。
2. 用预热1x DPBS洗涤细胞单层两次。
3. 用补充有250μg/ ml卡那霉素的RPMI替换组织培养板中的培养基，并孵育单层细胞1小时。
  注意：250μg/ ml可在1小时内消除≥90％的细菌，并维持巨噬细胞活力≥95％。为了维持细胞活力，1小时后抗生素浓度会降低。
4. 取出培养基并更换为补充有50μg/ ml卡那霉素的RPMI培养基。＆nbsp;
5. 在感染后37℃孵育细胞总共4和8小时。
巨噬细胞裂解和测量（图1H）
1. 丢弃培养基并用0.5 ml 0.1％Triton X-100裂解缓冲液替换（参见食谱）。
2. 通过使用P1000 Pipetman（即，至少50次）上下吸移几次来完全均化细胞单层，直至观察不到细胞簇。＆nbsp;
3. 将每个孔的全部内容物转移到1.5ml Eppendorf管中并标记。
4. 以500 x g 旋转细胞10分钟，然后尽可能多地去除溶液。＆nbsp;
5. 将细胞重悬于1ml预热的LB培养基中。
6. 在无菌1.5ml Eppendorf管中将每个样品连续稀释（即，1：10）。
7. 将50μl重悬细胞裂解液应用于预热的LB琼脂平板上（参见配方）。
8. 用无菌L形涂布器（即，曲棍球棒）将细胞裂解物的内容物扩散到LB琼脂平板的表面上。
9. 将预先标记的板正面朝上放置10分钟，然后倒置并在37℃下储存。＆nbsp;
10. 将LB琼脂平板孵育48小时。
  注意：孵育24小时后，应从培养箱中取出平板并对CFU进行定量分析。 24小时后可能会出现一些菌落。应在初次孵育后48小时对板进行验证并进一步分析。
11. 使用以下等式量化CFU：
  （CFU的x DF）/体积分布在LB板的表面上
  DF =用于培养细菌的稀释因子
  CFU =在一个平板上计数的总菌落数
  例如： B的150个菌落。在稀释3（1：1,000）的平板中的thailandensis ; 150×10 3 （稀释因子）/0.050ml（LB平板上的体积扩散）= 3×10 6 CFU / ml
图1.在狂欢酒精和吞噬作用方案的不同时间点的代表性图像。：一种。在T-75组织处理的烧瓶中生长的肺泡巨噬细胞（AM）。 B.将定量的AM以5×10 5个/孔细胞/孔的密度接种到24孔板组织培养物中。 C.用单次暴饮酒精剂量（0.08％v / v）攻击AM。 D.将细胞在低蒸发组织培养板中孵育，并应用狂欢酒精补偿系统（白色箭头）。 E.AMs后用IFN-γ引发酒精攻击。 F.感染AM并将组织培养板离心以增加AM-细菌相互作用以进行吞噬和细胞内侵袭。 G.AMs用250μg/ ml处理1小时，然后用50μg/ ml卡那霉素处理以消除细胞外细菌。 H.感染后4和8小时后，将AM洗涤，裂解，连续稀释，并在LB琼脂平板上生长活细菌。与对照（非酒精处理的细胞）相比，每个实验组对CFU进行定量和平均。

数据分析

对于数据分析，为了评估菌落形成单位（CFU），我们使用至少三个实验重复。对于每个实验重复，我们分析了每个稀释度3个测定重复（即，3个LB琼脂平板用于10 1 ，10 2 ，10 3 稀释液）。我们拍摄每个LB琼脂平板的图像，计算每个LB琼脂平板上的细菌菌落，并分析CFU平板形成后24小时和48小时的菌落形成（Jimenez et al。，2017）。＆nbsp ;
对于统计分析，我们使用GraphPad Prism。为了比较两个数据集，我们执行学生的 t - 测试。

笔记

当离心细菌亚培养时，我们建议光密度（OD）接近0.5，因为在RPMI无抗生素培养基中重悬时可能会失去细菌。
我们建议在使用前将所有试剂保鲜。
该方案可用于测试暴食酒精毒性对具有不同细菌（野生型）感染的AM的影响。
注意：应进行初步研究以确定AM感染前的细菌生长条件和抗生素敏感性。

食谱

10％FBS / 1x DPBS（10 ml）
注意：使用前要新鲜。
1. 在9毫升1x DPBS中，加入1毫升FBS
2. 过滤灭菌（0.22μm），等分并储存在-20°C
1x抗生素/霉菌（10 ml）
在9,900μl的1x DPBS中，加入100μl抗生素/霉菌（100x）
肺泡巨噬细胞培养基（RPMI）
注意：媒体是用50毫升股票制作的。
添加所有组件：
0.5毫升HEPES
0.75毫升碳酸氢钠
0.5毫升非必需氨基酸
0.5毫升抗生素/霉菌（1x）
5毫升FBS
42.75毫升RPMI培养基
注意：基础媒体到达时补充了购买提供商的L-谷氨酰胺。
200 U /μlIFN-γ（1 ml）
1. 比活度为2 x 10 7 U / mg或1 x 10 4 U /μg
2. 将20μg溶解在1ml 1x DPBS中并产生2×10 5 sup / 5 u / ml
3. 将每个试管的原料分装成10,25,50μl，以最大限度地减少冻融循环
4. 使用200U /μl的IFN-γ等分试样
0.08％乙醇
注意：在使用前保持新鲜并允许达到室温。
在999.2μl组织培养基中加入0.8μl200标准无水乙醇（100％）
250或50μg/ ml卡那霉素（1 ml）
1. 在1毫升DPBS（1x）中，溶解1毫克或1,000微克卡那霉素（原液）
  注意：在稀释前完全溶解粉末。
2. 在750μl的1x DPBS或组织培养基中，加入250μl的1mg原液，250μg/ ml
3. 在950μl的1x DPBS或组织培养基中，加入50μl的1mg原液，50μg/ ml
10％Clorox漂白剂（500毫升）
注意：使用前要新鲜。
在450毫升去离子水中，加入50毫升100％（未稀释）的漂白剂
0.1％Triton X-100（50 ml）
在49,950μl的1x DPBS中，加入50μl（未稀释的）Triton X-100
LB肉汤（1升）
将25克LB肉汤粉末溶解于1升去离子水中，在121℃下高压灭菌30分钟并在室温下储存
LB板
在高压灭菌过程中，在121°C下加入15克琼脂加入1升LB肉汤中倒入，然后倒入
将约20毫升液体倒入无菌培养皿中。使用前让介质冷却并硬化

致谢

该协议是Jimenez 等人（2017）中描述的协议的扩展版本。该研究得到了国防部（DTRA）[HDTRA1-14-C-0022]的资助。我们感谢北亚利桑那大学The Pathogen Microbiome Institute（PMI）的研究员对优化该测定的有用建议以及Paul Keim博士慷慨提供 B。 thailandensis 。此外，我们感谢Becky Coleman博士对初步方法的指导和指导。

利益争夺

作者声明没有利益冲突。

参考

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