材料和试剂

5-8只胎儿（1-3天龄）BALB/C小鼠（Harlan）
冰块
DMEM（Sigma-Aldrich，目录号：D5796）
胎牛血清热灭活（FBS）（Sigma-Aldrich，目录号：F9665）
不含酚红的D-Hank平衡盐溶液（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：H6648）
胰蛋白酶/EDTA（0.05％/0.02％）（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：25300054）
酒精（70％）
聚D-赖氨酸溶液（10μg/ml）（Sigma-Aldrich，目录号：L202）
70％酒精
生理盐水（0.9％）（Sigma-Aldrich，目录号：07982-100TAB-F）
胰蛋白酶（0.25％）（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：25200-072）
使用两种不同浓度的具有FBS的DMEM以使生长最大化。这背后的逻辑是微胶粒在酶消化后更"敏感"。因此，具有更高浓度的FBS（即15％）的DMEM的使用在解聚之后提供另外的生长因子和缓冲剂，并且在酶暴露之前其使用是允许细胞适应这种更高的浓度并优化该细改善生长条件。 DMEM + FBS 10％足以在所有其他时期进行培养。

设备

直剪
弯曲剪刀
角膜剪刀
直钳（小，x2）
弯曲动脉钳（×3）
烧杯（100ml，x2）
培养皿（30mm，x2）
培养瓶（25cm 2和75cm 2）
离心Falcon管（15ml和50ml）
血清移液管（2 ml和5 ml）
塑料移液管（3.5 ml）
70-μm尼龙细胞过滤器
无菌纱布
培养箱（37℃; 5％CO 2;加湿）
冷冻离心机
放大镜和显微镜
紫外线
具有混合胶质细胞的培养瓶
parafilm
酒精燃烧器
冷冻离心机
轨道摇床/肚皮舞（37℃）
预先用聚-D-赖氨酸包被的24孔组织培养板

程序

注意：在处理动物和细胞培养物时应遵守生物安全实践（II级）。
注意：所有程序均在无菌条件下进行。

阶段1：通过酶消化分离和培养鼠小神经胶质细胞小鼠脑组织与胰蛋白酶的酶解聚合提供了高产率的小胶质细胞，没有任何可检测的细胞活化。
1. 用5ml聚-D-赖氨酸（10μg/ml）包被75cm 2培养瓶的底部，并使其在室温下放置过夜（注意：Poly-D- 赖氨酸帮助细胞粘附于烧瓶上）。
2. 在实验当天，除去任何过量的聚-D-赖氨酸，因为任何过量的溶液对小胶质细胞都是苛性的。然后将烧瓶用PBS洗涤一次。另外清洁的文化橱柜/罩子暴露于额外的30分钟的UV光，以最大化灭菌过程。
3. 通过用一把剪刀切割两个颈动脉（不使小鼠断头，否则难以进行随后的处理）来挑取5至8只胎儿BALB/c小鼠（1-3天龄），将头部置于具有70 ％酒精15-30秒。步骤（3）至（g）由图1（见下文）表示。
4. 去掉头盖，用一片无菌纱布除去所有过量的血液和酒精。
5. 接下来，在无菌技术下清除颅骨上的皮肤。这是通过在颅骨上的十字架切口（在头骨的基部的横向切口和沿着颅骨的中线的垂直切口直到颅骨的前部）实现的。然后使用新的直镊子剥离在头皮上的皮肤以完全暴露颅骨。
6. 识别λ和矢状缝合线。使用一对角膜剪刀沿着缝合线切割。然后使用一对3直的镊子来"剥离"头骨（注意：这个年龄的老鼠的头骨是非常柔软和柔韧的），并且完全暴露大脑（n°ote：必须在冰上进行以下2个步骤以最小化细胞丢失）。
7. 然后将新的弯曲镊子插入大脑底部（注意不要损伤大脑）。轻轻地抬起大脑远离骷髅基地。将大脑放在一个小的文化菜含有少量D-Hanks平衡盐溶液。
8. 然后在放大镜下使用两个小直镊子轻轻地移除脑膜内层（硬脑膜和蛛网膜层）。然后将清洁的脑置于具有2ml胰蛋白酶/EDTA（0.05％/0.02％）的新培养皿中。然后使用一对角膜剪刀将大脑切成细浆。
9. 使用5ml血清移液管将脑/胰蛋白酶悬浮液轻轻转移到15ml离心管中，并加入相同体积的胰蛋白酶/EDTA（0.05％/0.02％）。然后将管在37℃下在湿润的5％CO 2气氛中在培养箱中保持8-10分钟以允许酶促解聚。
10. 在分配的时间后，将具有10％FBS的DMEM加入到悬浮液（1:1比例）中以中和胰蛋白酶。通过使用3.5ml塑料转移移液管上下移动溶液20分钟轻轻搅动单细胞悬浮液，小心避免形成气泡。
11. 将悬浮液在室温下静置一分钟以使任何大块沉淀。将该上清液通过70μm尼龙细胞过滤器进入另一个100ml烧杯中。使用具有更多具有10％FBS（等于上清液的体积）的DMEM和应变的3.5ml塑料转移移液管的搅拌过程重复两次。
12. 然后使用血清移液管将所有过滤的流体轻轻转移到50ml离心管中。然后将其在冷却（4℃）的离心机中在190×g离心8分钟。
13. 然后弃去上清液，将细胞沉淀重悬于15ml含有15％FBS的DMEM中
14. 将重悬浮的细胞加入到聚-D-赖氨酸包被的烧瓶中并在37℃下在潮湿的5％CO 2气氛中温育。 3天后，用新鲜批次的15ml含有10％FBS的DMEM替换DMEM。此后，每隔一天使用含有10％FBS的新鲜DMEM和烧瓶培养基的上清液的1:1混合物更换培养基，以除去任何死细胞并保留细胞先前释放的现有生长因子。这通过将现有的15ml通过血清移液管移入50ml离心管期，然后立即用7.5ml具有10％FBS的新鲜DMEM置换来实现。然后将该"旧"培养基在190×g离心以去除死细胞。为了制备烧瓶所需的15ml，加入7.5ml离心的上清液。该过程可重复长达10-14天。
15. 当细胞约80-90％汇合时，它们可以用于纯化
阶段2：从混合的神经胶质细胞培养物中纯化鼠小神经胶质细胞
1. 一旦混合的神经胶质细胞培养物达到90％汇合水平（在10-14天后），可以使用加热的轨道摇床/肚皮舞蹈机在240rpm下将小神经胶质细胞从烧瓶中分离1.5-2小时（37℃）。在解聚之前二十小时，用含有15％FBS的新鲜DMEM替换培养基。
2. 第二天，将烧瓶以200-240rpm/min在37℃下放置在加热的定轨振荡器上2小时。
3. 将悬浮液转移到50ml离心管中，然后在190×g离心8分钟。
4. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于含有15％FBS的新鲜DMEM中。
5. 然后将细胞接种到已经用5ml聚-D-赖氨酸（10μg/ml）预包被的24孔组织培养板上。将细胞分配到7.5×10 4个细胞/孔中并在37℃下在湿润的5％CO 2中孵育。 span> 气氛。每2-3天用含有10％FBS的新鲜DMEM更换培养基。使用显微镜定期观察细胞生长（图2）。细胞产量为1×10 6个小胶质细胞/小鼠。
6. 将原始混合胶质细胞烧瓶用10ml含10％FBS的新鲜DMEM补充。此后，使用如上所述的含有10％FBS的新鲜DMEM和烧瓶培养基的上清液的1:1混合物每2-3天更换培养基。然后可以在一周后重复上述纯化过程。在将细胞铺在24孔板中后，细胞必须在一周内使用（对于前3天是最佳的）。可以使用抗CD11b单克隆抗体通过流式细胞术来评估细胞纯度
  
  图1.从1-3天老鼠移除大脑的方法
  
  图2.光学显微镜上的小神经胶质

致谢

这项工作是由国家自然科学基金（中国授予30972718和81273242），江苏省自然科学基金（授予BK2012605）和江苏省创新和创业人才（2011-2014）。

参考文献

Chen，X.，Quinn，E. M.，Ni，H.，Wang，J.，Blankson，S.，Redmond，H. P.，Wang，J.H。和Feng， B7-H3参与实验性肺炎球菌性脑膜炎的发展，通过增加TLR2- 依赖机制。 189（1）：347-355。，tahoma，verdana，helvetica; font-size：12px; line-height：1.5; text-align：start; text-indent：-17.85pt;">