材料和试剂

设备

软件

程序

图1.实验程序摘要。简而言之：A-C。解剖胚胎小鼠的肢芽。 d-E。用酶（分散酶和胶原酶）消化它们。 F-我。以高密度培养细胞。 J.加入软骨形成培养基并孵育6天。 K.Alcian蓝染色。

细胞的制备
1. 从小鼠胚胎第12.5天（图1B中被圆圈包围的部分）解剖肢芽。一个肢芽足以诱导2或3个软骨孔（图1A-1C）。
2. 将肢芽收集在1.5ml管中并加入1ml酶溶液（0.1％Dispase，0.1％胶原酶在D-MEM / Ham's F-12中）（图1D）。
3. 在微管旋转器（AS ONE）上以60rpm旋转管，在37℃下旋转1.5小时（图1E）。
4. 将试管在300 x g 下离心5分钟，并将细胞重悬于1ml D-MEM / Ham's F-12中（图1F）。
5. 将细胞悬浮液应用于置于5ml圆底管中的40μm细胞过滤器，并使用自动细胞计数器（Bio-Rad）测量细胞密度（图1G）。
软骨形成
1. 将试管在300 xg 下离心5分钟，并将细胞重悬于含有10％FBS的D-MEM / Ham's F-12中，以将细胞密度调节至1.5×10 7 细胞/ ml（图1H）。
2. 将10μl液滴置于4孔培养板中，并将细胞在CO 2 培养箱中孵育1.5小时（图1I）。
3. 加入500μl软骨形成培养基（含有10％FBS和50μg/ ml L-抗坏血酸的D-MEM / Ham's F-12），小心不要破坏液滴并在CO 2 培养箱中孵育（图1J）。
4. 每2天更换培养基并孵育6天。
阿尔新蓝染色（图1K）
1. 将细胞固定在500μl4％PFA中10分钟，并使用Milli-Q水洗涤细胞两次。
2. 加入500μl1％乙酸5分钟，用500μl阿尔新蓝溶液代替乙酸30分钟。
3. 用500μl1％乙酸洗涤细胞，并用Milli-Q水洗涤两次。
4. 使用光学显微镜对染色的细胞成像（图2）。
  
  图2.阿尔新蓝染色

数据分析

用ImageJ软件测量阿尔新蓝染色区域（Abramoff 等人，，2004）。应对获得的数据进行适当的统计分析。

食谱

酶解决方案
在D-MEM / Ham's F-12（Wako）中溶解分散酶（Gibco）和胶原酶（Wako）（各0.1％w / v）并用0.22μm注射器过滤器（Millipore）过滤
L（+） - 抗坏血酸原液
将抗坏血酸（Wako）（50 mg / ml）溶解在PBS（ - ）中，并用注射器过滤器（Millipore）过滤
软骨形成培养基
含有10％FBS（Sigma）和50μg/ ml L-抗坏血酸的D-MEM / Ham's F-12（Wako）
8％PFA原液解决方案
将40 g PFA（Wako）加入400 ml热的Milli-Q水（60°C）中，加入50μl10N NaOH（Wako），继续搅拌直至PFA溶解。加入50毫升10倍PBS（ - ）并调节至最终体积为500毫升
1％醋酸溶液
将1ml乙酸（Wako）加入99ml Milli-Q水中
阿尔新蓝溶液
将1克阿尔新蓝8GX（Sigma）溶于100毫升3％乙酸溶液（Wako）中，并用滤纸（ADVANTEC）过滤

致谢

这项工作部分得到了日本科学促进会（16H05131和17KT0051到E.H.），日本医学研究和发展局（E.H.的17824969）的支持。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

该研究方案符合日本药理学会的指导方针，并获得日本金泽市金泽大学实验动物伦理使用委员会的批准。

参考

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