材料和试剂

材料
1. 移液器吸头（Thermo Fisher Scientific，目录号：90030130-P，90030230-C）
2. 96孔组织培养板（Himedia，目录号：TPP96 1X100NO）
3. 带过滤盖的组织培养瓶（TPP，目录号：90026）
4. 无菌15毫升离心管（Abdos，目录号：P10402）
5. 0.22μm过滤器（Himedia，目录号：SF9 1X75NO）＆nbsp;
细胞
A549人肺癌细胞系（NCCS）
注意：这些细胞系在含有10％FBS，1％pen-strep的DMEM培养基的完全培养基中培养，并在培养箱中维持在37℃，5％CO 2 。 / em>
试剂
1. DMEM培养基（Thermo Fisher Scientific，目录号：12100046）
2. 青霉素 - 链霉素（Pen-Strep）（Himedia，目录号：A007）
3. 胎牛血清（Thermo Fisher Scientific，目录号：11573397）
4. 0.25％胰蛋白酶-EDTA（Thermo Fisher Scientific，目录号：25200056）
5. Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（Himedia，目录号：TL1022）
6. 刃天青钠盐（Alamar Blue）（Sigma-Aldrich，目录号：R7017）
7. MTT（Himedia，目录号：TC247 5X30MG）
8. 二甲基甲酰胺溶液（Sisco Research Laboratories，目录号：16616）
9. 冰醋酸（Sisco Research Laboratories，目录号：90868）
10. 十二烷基硫酸钠（Sisco Research Laboratories，目录号：32096）
11. 刃天青（0.15 mg / ml）在PBS中的储备液（参见食谱）
  注意：刃天青是一种光敏染料，因此应存放在黑暗中。
12. PBS中的MTT溶液（5mg / ml）（参见配方）
  注意：它应该是光保护的，并存储在-20°C下长期存放。
13. 增溶缓冲液（见食谱）

设备

微量移液器（SL-20，SL-200，SL-1000，Rainin）＆nbsp;
Balance（XB 220A Precisa，UK）
血细胞计数器（Marienfeld，目录号：0610010）＆nbsp;
CO 2 孵化器（Panasonic，Multigas Incubator）＆nbsp;
生物安全柜2级（CHC实验室，CHC-777A2-04 Biolus）
倒置显微镜（Zeiss，Primovert）
台式离心机（Remi）
Elisa Plate Reader（Thermo Scientific，Thermo Multiskan GO）
紫外光可见分光光度计（Thermo Scientific，型号：Evolution 201）

程序

Alamar蓝测定
1. 当细胞处于生长的对数期时收获细胞，并在烧瓶中的细胞汇合时使用血细胞计数器计数细胞（图2）。
  
  图2.细胞计数。：一种。通过移取盖玻片下的细胞悬液加载血细胞计数器室。 B.将血细胞计数器放在显微镜下并计数细胞。
2. 将细胞在96孔板中以100μl完全培养基中每孔1×10 4个细胞密度接种，使1天后达到70-80％汇合（图3））。
  
  图3.细胞接种。 A.将孔稀释并接种至细胞密度为1×10 4个细胞。 B.该图代表完整的种子微孔板。
3. 将接种的平板保持在37℃，5％CO 2 ，95％湿度的CO 2 培养箱中24小时，以促进细胞生长和细胞粘附到板表面（图4）。
  
  图4.将96孔板在CO 2 培养箱中孵育
4. 用1x PBS洗涤每个孔两次，并在100μl完全培养基中用不同浓度的银纳米颗粒处理细胞。包括适当的空白培养基，未处理的种子孔。将细胞在培养箱中孵育24小时（图5）。
  
  图5.用银纳米粒子处理细胞
5. 无菌添加Alamar蓝，其量等于孔体积的10％（图6）。
  
  图6.在每个孔中加入Alamar蓝色
6. 在CO 2 培养箱中孵育2-4小时。最佳培养时间随细胞类型和接种密度而变化。
7. 通过记录孵育后在570nm和600nm波长处的吸光度来确定细胞毒性和增殖。没有细胞的完整培养基，包括Alamar蓝，应视为空白（图7）。
  
  通过Alamar蓝测定分光光度法测定细胞增殖
  处理细胞和对照细胞之间细胞减少百分比的差异：
  
  在哪里，
  E1 =氧化的Alamar蓝在570nm处的摩尔消光系数（E），80586
  E2 = 600nm处氧化的Alamar蓝的摩尔消光系数，117216
  A1 =样品孔在570nm处的吸光度
  A2 =样品孔在600nm处的吸光度
  B1 = 570nm处的生长控制吸光度
  B2 = 600nm处的生长控制吸光度
  
  通过Alamar蓝测定法对细胞毒性进行荧光测定
  观察激发和发射波长分别为560和590 nm的荧光。
  
  图7.通过Elisa读板器记录的吸光度
MTT检测
1. 在细胞培养瓶中新鲜收获细胞，并在烧瓶中的细胞融合时使用血细胞计数器计数细胞。
2. 将细胞在细胞密度为1×10 4 /μL的96孔微孔板中培养，每孔100μl完全培养基。
3. 将平板在5％CO 2 ，37℃，95％湿度下孵育24小时，直至平板中的培养物为70％-80％汇合。
4. 用1x PBS洗涤每个孔并用不同浓度的银纳米颗粒处理细胞。采取适当的控制措施，包括空白和未经处理的井。将培养皿中的培养板再保持24小时。
5. 加入MTT试剂，其量等于孔总体积的10％。对于总体积为100μl，向孔中添加10μlMTT试剂，包括对照。
6. 再次孵育平板2-4小时（孵育时间随用于研究的细胞系类型而变化）。
7. 在孵育过程中形成甲crystals晶体后，向孔中加入100μl增溶缓冲液。＆nbsp;
8. 轻轻搅拌以确保适当的溶解。
9. 使用分光光度计或ELISA板读数器记录570nm处的吸光度。测量高于650 nm的参考波长，以计算细胞碎片和未溶解颗粒的背景噪音。
  
  通过MTT法分光光度法测定细胞增殖
优点和局限
MTT法是一种终点分析方法，虽然它是最广泛研究的方法之一，但由于其细胞毒性，它具有局限性。据报道，形成的甲crystals晶体在胞吐作用期间刺穿细胞膜，从而损害细胞。相反，Alamar blue比MTT测定具有一定的优势，包括时程测量分析，灵敏度和准确度提高，无细胞裂解，适用于测量后功能研究。使用四唑鎓和刃天青染料评估细胞毒性的基本缺点是需要用这些还原染料孵育细胞以产生信号。由于测试化合物，用于测定的化学品和细胞生物化学之间的相互作用，这倾向于导致伪影发生的可能性增加。

数据分析

Alamar蓝的％减少量按照前一节中描述的公式计算。

下面显示了一个示例：
E1 = 80586
E2 = 117216
A1 = 0.53
A2 = 0.25
B1 = 0.82
B2 = 0.13

这表示与对照孔相比，处理孔的减少量为55.25％。换句话说，试验化合物使细胞生长受到44.4％的抑制，表明其在特定浓度下的抗癌活性。

笔记

所有实验都应重复进行，以获得统计学上显着的数据，即， P ≤0.05。
在开始任何实验之前优化诸如平板密度，孵育时间等因素，因为孵育时间和细胞密度随着用于研究的细胞系类型而变化。

食谱

刃天青（0.15mg / ml）在PBS中的储备液
1. 在15ml无菌离心管中称取1.5mg刃天青，并向其中加入10ml无菌PBS
2. 旋转管直至刃天青完全溶解
3. 过滤将储备溶液灭菌到新的15ml无菌离心管中
4. 储备溶液应保持在2-8°C，以便长期储存
PBS中的MTT溶液（5mg / ml）
1. 将5 mg MTT溶于1 ml Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（pH 7.4）中
2. 过滤器将MTT溶液通过0.22μm过滤器灭菌到新鲜的无菌容器中
3. 将溶液储存在-20°C下长期储存，在4°C下储存以备常用
增溶缓冲液
1. 在2％（v / v）冰醋酸中制备40％（v / v）二甲基甲酰胺（DMF）溶液
2. 向溶液中加入16％（w / v）十二烷基硫酸钠（SDS），并适当混合
3. 将整个溶液的pH调节至4.7
4. 为避免SDS沉淀，将缓冲液储存在室温下

致谢

Surendra Nimesh承认印度政府提供的生物技术部（DBT）（第6242-P82 / RGCB / PMD / DBT / SNMH / 2015号授权）的财政援助。该协议已经从我们之前在Arya 等人（2018）中的出版物中修改过。 Artif Cells Nanomed Biotechnol 46（5）：985-993。

利益争夺

作者声明他们没有利益冲突。

参考

Arya，G.，Kumari，R.M.，Gupta，N.，Kumar，A.，Chandra，R。和Nimesh，S。（2018）。使用 Prosopis juliflora 树皮提取物绿色合成银纳米粒子：反应优化，抗菌和催化活性。 Artif Cells Nanomed Biotechnol 46（5）：985-993。
Kumari，R.M.，Thapa，N.，Gupta，N.，Kumar，A。和Nimesh，S。（2016）。使用生物合成的银纳米粒子的抗菌和光催化降解功效Cordia dichotoma 叶子提取物。自然科学进展：纳米科学和纳米技术 7（4）045009。
Präbst，K.，Engelhardt，H.，Ringgeler，S。和Hubner，H。（2017）。基本比色增殖试验：MTT，WST和刃天青。方法Mol Biol 1601：1-17。
Rampersad，S。N.（2012）。 Alamar Blue的多次应用，作为细胞活力生物测定中代谢功能和细胞健康的指标。传感器（巴塞尔） 12（9）：12347-12360。