材料和试剂

1x胰蛋白酶-EDTA（0.05％/0.02％，在PBS中）（PAA Laboratories GmbH，目录号：L11-004）
DPBS，钙，镁（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：14040）
具有钙和镁且不含红色酚的HBSS Hank's平衡盐溶液（HBSS）（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：14025）
CM-H 2 DCFDA（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：C6827）
碘化丙啶-1.0mg/ml（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：P3566）}

设备

细胞培养箱
六孔板
离心机
FACSVantage SE（Becton Dickinson）
2×75mm，5ml聚苯乙烯圆底试管（BD Biosciences，目录号：352054）

程序

在下面描述的协议中，我们检测在非癌性人甲状腺上皮细胞系"HTori-3.1"暴露于氧化应激后的细胞内ROS。 HTori-3.1细胞在完全培养基中生长（参见Recipes）。

将HTori-3.1细胞以2.5×10 5个细胞/孔的密度接种在完全培养基中的六孔板中。
16小时后，通过温热的DPBS洗涤细胞（90％汇合），通过胰蛋白酶消化收集（250μl胰蛋白酶/孔）。
加入1毫升完全培养基（10％FCS）停止胰蛋白酶消化和重悬细胞通过轻轻吹吸上下。
通过在室温下离心（在200×g下5分钟）将细胞收集到5ml聚苯乙烯圆底管中，并抽吸上清液。
用4ml DPBS洗涤细胞沉淀，并在室温下以200×g离心5分钟。
将细胞沉淀物在HBSS中用10μmol/L的CM-H 2 DCFDA和增加的H 2 O 2 sub（1 - 5 - 10 -15 - 20 - 25和50μmol/L），通过轻轻吹打上下（500μl/管）。
将细胞（重悬于管中）在黑暗中孵育45分钟，在细胞培养箱[（37℃），高相对湿度（95％）和控制的CO 2级（5％）] br />
加入碘化丙啶0.5μl/0.5ml /管（终浓度=1μg/ml）并将管置于冰上（仍然在黑暗中），并立即进行流式细胞术分析。注意：a）碘化丙啶染色程序应当在流式细胞仪上分析之前立即进行，b）当我们将管置于冰上时，我们使细胞活性最小化，并且避免FACS中分析的第一个管之间的ROS检测的伪影波动，随后管。
在流式细胞术中分析总共5,000个事件。
通过碘化丙啶染色评估细胞存活力。在FACSVantage SE（Becton Dickinson）的FL-3通道（620nm）中收集PI荧光。
通过FACS门控选择PI阴性的活细胞。在这些活细胞中，我们记录DCF在FACSVantage SE（Becton Dickinson）的FL-1通道（525nm）上的荧光。

分析

通过流式细胞术分析测定1至50μmol/L的H 2 O 2 subsubs浓度对细胞内ROS水平的影响。（图1）。我们可以将结果表示为"所有平均荧光"或"M2百分比"荧光变化。 M2表示具有增加的ROS产生的细胞的百分比。我们测量荧光的浓度依赖性增加，反映细胞内ROS水平增加（图1）。

例如，在将细胞暴露于20μMH 2 O 2 2后，我们检测到HTori3.1细胞的荧光增加[所有细胞的平均荧光在压力下为243.14在无应激细胞（0μMH 2 O 2 O 2）中为76.76。我们的结果表明，应激细胞中ROS的水平是没有应激细胞的3倍此外，我们可以通过"M2和M1百分比"荧光变化分析结果。 M1放置在无应力单元周围。 M2放置在M1的右边，以指定正事件。我们观察M2的门控百分比：1.23％（无应激细胞）和47.12％（用20μMH 2 O 2 O 2应激的细胞）。我们的结果表明，47.12％的细胞在暴露于20μMH 2 O 2 O 2后显示出ROS水平的增加。

食谱

完全培养基：补充有1％（v/v）抗生素/抗真菌剂（Life Technologies，Invitrogen TM）的无酚红RPMI 1640（Life Technologies，Invitrogen ），2mmol/L的L-谷氨酰胺（Life Technologies，Invitrogen ）和10％（v/v）FCS（PAA Laboratories）。

致谢

该协议改编自Ameziane-El-Hassani等人（2010）。

参考文献

Ameziane-El-Hassani，R.，Boufraqech，M.，Lagente-Chevallier，O.，Weyemi，U.，Talbot，M.，Metivier，D.，Courtin，F.，Bidart，JM，El Mzibri，，Schlumberger，M。和Dupuy，C。（2010）。 H ₂ O ₂的作用 RET/PTC1染色体重排由人甲状腺细胞中的电离辐射产生。癌症研究70（10）：4123-4132。