材料和试剂

移液器吸头
2毫升螺旋盖聚丙烯微量瓶（Biospec Products，目录号：3205）
Hamilton ®微量注射器系列700,0.25 ml（Sigma，目录号：24538-U）
Hamilton针，51 mm（Sigma，目录号：21746）
Binder Clip（得力8584，Luma交易）
磁力搅拌棒，直径5毫米，长20毫米
透明塑料薄膜
1.5毫升光谱比色皿（Fisherbrand PS，目录号：7755.0302）
蓝细菌 Synechocystis sp。的葡萄糖耐受菌株。 PCC6803（GT-P，Tichý等人，2016）
丙烯酰胺用于分子生物学（AA）（AppliChem Panreac，目录号：A3812,1000）
用于分子生物学的双丙烯酰胺（BIS）（AppliChem Panreac，目录号：A3636,0250）
6-氨基己酸（ACA）（AppliChem Panreac，目录号：A2266,500）
Bis-Tris（AppliChem Panreac，产品目录号：A1025.1000）＆nbsp;
MES（AppliChem Panreac，目录号：A0689.0250）
Tricine（AppliChem Panreac，目录号：A1085,1000）
N，N，N'，N'-四甲基乙二胺（TEMED）（Sigma，目录号：T928-25ml）
过硫酸铵（APS）（Sigma，目录号：T3678-25g）
二硫苏糖醇（DTT）（AppliChem Panreac，目录号：A1101,0025）
SDS（Sigma，目录号：7172-100g）
直径150-212μm的玻璃珠（Sigma，目录号：G1145）
正十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DM）（AppliChem Panreac，目录号：A0819,0005）
脱氧胆酸钠（Sigma，目录号：30970-25g）
用于蛋白质分子量的凝胶过滤标记试剂盒（Sigma，目录号：MWGF1000-1KT）
CaCl 2 （分析级）
MgCl 2 （分析级）
甲醇（分析级）
氢氧化钠（分析纯）
盐酸（分析级）
甘油（HPLC级）
Milli-Q去离子水（Merck Millipore，Ultrapure [Type 1] water）
缓冲液B（见食谱）
凝胶缓冲液6x（pH 7.6）（见食谱）
丙烯酰胺溶液（AB）（见食谱）
上部（阴极）缓冲液10x（见食谱）
上部（阴极）缓冲液1x（见食谱）
较低（阳极）缓冲液10倍（见食谱）
下（阳极）缓冲1x（见食谱）
解析凝胶和堆积凝胶（见食谱）

设备

自动移液器（P1000，P200和P10）
Mini-beadbeater（西格玛，产品目录号：Z249289）
磁力搅拌器Color Squid White（Thermo Fisher Scientific，目录号：6110.1005）
GE梯度制造商（Sigma，目录号：GESG50）＆nbsp;
Vortex（Velp Scientifica，型号：RX3）
离心机（海蒂诗，型号：Micro22 R）
UV-VIS分光光度计（Shimadzu，型号：UV3000）
冷却微量离心机（Eppendorf，型号：5415R）＆nbsp;
PAGE装置（Bio-Rad，PROTEAN ® II xi Cell）
电源（Bio-Rad，PowerPac TM HV高压）
冷却恒温器（Labio，型号：CTB 06C）
LAS 4000相机（富士;叶绿素荧光扫描使用LED蓝光光源460 nm激发，R670滤光片用于发射）
扫描仪HP ScanJet G4050（HP，型号：G4050）
pH计（赛多利斯，PB-11）
FIM-150片状制冰机（Biobase）

软件

ImageJ与Java 1.8.0_112捆绑在一起（ https://imagej.nih.gov/ij/download.html ）

程序

该方案需要在35μmolm -2 s的冷白色荧光灯下，在轨道振荡器（约60rpm）下在30℃下生长的20ml Synechocystis PCC 6803 <液体BG11中的sup> -1 （Rippka et al。，1979），在750nm处光密度为~0.4-0.6（参见注释）。通过在~4℃下在2,300×g离心10分钟收集蓝细菌细胞，将细胞沉淀重悬于1.5ml缓冲液B中，并将重悬浮的细胞转移到2ml螺旋盖微管中。从这一点开始，将管子保持在冰上。
将离心管在9,300 xg 中于4°C离心2分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于0.15 ml缓冲液B中，加入相同体积的玻璃珠（分别测量将0.5ml微管刻度，并加入带有样品的2ml微管中。
在Mini-Beadbeater中以30秒（最大速度）和1分钟冷却的三个循环打破细胞。
加入0.2ml缓冲液B，将管涡旋2秒，立即将上清液转移到新的预冷2ml螺旋盖微管中，重复5次。
将管在400℃下在4℃下离心1分钟以除去未破碎的细胞和玻璃珠。
将上清液转移到新的预冷却的2ml螺旋盖微量瓶中，并在4℃下以16,000 x g 离心20分钟。
除去上清液，用0.25 ml微量注射器（长度120 mm，直径2 mm）的不锈钢活塞将沉淀重悬于0.2 ml缓冲液B中：取出上清液后，将颗粒置于颗粒中第二只手，将活塞插入管子直至底部并用插入的活塞涡旋15秒，然后加入0.2毫升缓冲液并再次用活塞内部涡旋10秒。
测量悬浮液中的叶绿素（Chl）含量。将13.5μl悬浮液与1.5μl10％DM混合，在16,000 xg 离心5分钟，取10μl上清液，加入990μl甲醇螺旋盖小瓶，涡旋，离心机在16,000 xg 处理5分钟，取上清液并测量720和666 nm处的吸光度，C（μgChl/ ml）=（A 666 - A 720 ）x 1,269（Wellburn，1994）。
准备解析凝胶（见视频1）。
1. 首先根据制造商的说明从玻璃板和1 mm垫片组装凝胶盒。＆nbsp;
2. 然后使用磁力搅拌器和搅拌棒（每种溶液的组分显示在配方8中，一列是一种溶液，第二和第三列），对每种4％和14％的溶解凝胶溶液充分混合所有组分（除了APS！） ;然后在恒定温和搅拌下将APS加入两种溶液中。＆nbsp;
3. 将4％溶液与搅拌棒一起倒入位于磁力搅拌器顶部的梯度制造器的右侧隔室中。梯度制造器具有连接到硅胶管的入口，该硅胶管通向蠕动泵并且具有通向第二隔室的封闭连接通道。蠕动泵的出口使用粘合剂夹连接到与玻璃凝胶盒上部连接的皮下注射针。＆nbsp;
4. 小心地打开连接通道，使其充满4％溶液（如果释放更多溶液，将其移回右侧隔室）并再次关闭，然后将14％溶液添加到第二个（左侧）隔室中渐变制造者。＆nbsp;
5. 用移液管除去8.5毫升14％的溶液，直接加到玻璃盒底部进行凝胶聚合，然后立即开始以每分钟约10毫升的速度将剩余的溶液泵入玻璃盒中并平行打开连接制造商的隔间之间的通道。调节溶液的温和搅拌（每秒2转）。＆nbsp;
6. 倒出梯度后，取下针头，用0.25 ml注射器用0.5 ml蒸馏水将溶液覆盖在凝胶盒中，然后用Milli-Q水清洗梯度制造器和管道。观察水和4％溶液之间的界面，直到形成清晰的边界，然后用注射器除去水。＆nbsp;
视频1。浇注解析凝胶
准备堆积凝胶。将APS加入10 ml 4％溶液（配方8中的右栏）中，倒入聚合的溶解凝胶顶部，浸入10孔梳子，避免产生气泡，等待聚合反应;然后取出梳子并用Milli-Q水清洗孔。
将准备好的凝胶连接到冷却芯中，检查连接是否紧密并且没有用蒸馏水泄漏，倒出水并将带有凝胶的核心插入带有2升1x低缓冲液的电泳室中，连接冷却的硅管恒温器的核心，设定为4°C，并将200毫升的1x上部缓冲液倒入冷却核心的上部储液器中。
对于凝胶分析，取含有5μgChl的样品，加入相应体积的缓冲液B缓冲液以使所有样品达到相同的体积（通常为30μl），加入1/10体积的10％DM并立即以16,000 <离心em> xg 在4°C下保持20分钟。
取25μl溶解的膜并加载到凝胶孔中。
为了估计复合物的分子大小，可以使用蛋白质分子量的凝胶过滤标记试剂盒，加载30μl推荐的混合物。
关闭盖子，将其连接到电源并以15 mA的恒定电流模式运行1.5-2小时，电压上限为1,000 V（参见图1;运行电压逐渐增加至1,000 V，之后达到这个极限，电流下降了。

图1.带冷却恒温器（左）和电源（右上角）的电泳装置（右下角）的设置
在着色的前部距离井底部约8cm的距离后，关闭电源，取下盖子，拆下硅树脂冷却管并用电泳室中的凝胶取出冷却芯。
从玻璃盒中取出凝胶并将其包裹在透明塑料薄膜中。
将其传输到扫描仪中以获取彩色图像（300 dpi分辨率，48位颜色深度）。
将凝胶转移到LAS4000相机中，以透明模式拍摄tiff格式的16位灰度图像，以量化PSI的绿色条带（数字化DIA方法，最低托盘位置，3秒曝光，高分辨率模式）或使用落射荧光模式蓝色LED激发光（波长460 nm）引发叶绿素（但不是藻胆蛋白）荧光，同时发出的光通过R670滤光片（边长为670 nm的长通滤光片）定量PSII（荧光法，最低的托盘）位置，3秒曝光，高分辨率模式）（见图2）。

图2.凝胶的代表性彩色扫描（左对）和叶绿素荧光图像（右对），分离的光系统I和来自蓝细菌的光系统II复合物 Synechocystis PCC 6803 GT-P （Tichý et al。，2016）和光系统I-less突变体（Shen 左边的两个泳道显示彩色扫描，右边的荧光扫描用光系统II二聚体和单体的显性条带进行扫描，右边的一个荧光扫描。，1993）。蓝色条带（PBS frag。）代表藻胆体的片段，蓝藻天线，其荧光不会被蓝光引发。
根据用户指南使用ImageJ量化波段（ https://imagej.nih .GOV / IJ /文档/导向/用户指南.pdf ）。首先使用工具栏工具中的区域选择工具选择波段作为感兴趣区域（ROI），使用处理工具减去背景，并使用分析工具中的强度统计分析波段的强度。

笔记

除了蓝藻 Synechocystis PCC 6803之外，所述方案已经成功地测试了其他蓝藻菌株，例如 Synechococcus elongatus PCC 7942和 Synechococcus sp。 PCC 7002.对于绿藻 Chlamllaomonas reinhardtii ， Chlorella sorokiniana 和 Scenedesmus quadricauda 方案相同，只有较大的玻璃珠直径为0.5 mm（Sigma）应该用于破坏细胞。 CN PAGE的程序也可用于来自植物叶绿体的分离的类囊体膜。

食谱

缓冲液B（50毫升库存）
25mM MES / NaOH缓冲液（pH6.5）
10mM CaCl 2
10mM MgCl 2
25％甘油
分成10毫升等分试样并在-25°C冷冻保存（稳定至少6个月）
凝胶缓冲液6x（pH7.0,100ml）
300 mM Bis-Tris / HCl缓冲液
用4 M HCl调节至pH 7.0 储存在4°C（4°C下至少稳定6个月）
注意：通常准备100毫升。
丙烯酰胺溶液（AB）
50％AA
1.33％BIS
Milli-Q水
储存在4°C（稳定至少3个月）
注意：通常准备500毫升。
上部（阴极）缓冲器10x
0.5 M tricine
150 mM Bis-Tris / HCl
使用4 M HCl将pH调节至7.0
储存在4°C（4°C下至少稳定6个月）
注意：通常准备500毫升。
上部（阴极）缓冲液1x（一页200毫升）
1. 将20毫升上层缓冲液10倍加入180毫升Milli-Q水和1毫升10％脱氧胆酸钠中，使其达到0.05％终浓度
2. 加入0.4ml 10％DM至终浓度0.02％。
注意：在跑步前准备新鲜的。
下（阳极）缓冲10x
0.5 M Bis-Tris / HCl
用4 M HCl将pH调节至7.0
储存在4°C（4°C下至少稳定6个月）
注意：通常准备500毫升。
下（阳极）缓冲器1x（2 L）
用Milli-Q水将下部（阳极）缓冲液稀释10倍至较低（阳极）缓冲液1x
注意：此溶液在4°C下稳定至少3个月，可以重复使用三次。
解析凝胶和堆积凝胶
混合各个组分（左起第一列）得到4％（第二列）和14％（第三列）溶液用于制备分离梯度凝胶和4％溶液用于制备堆积凝胶（第四列）到下表：

致谢

这项工作得到了捷克共和国捷克教育，青年和体育部（LO1416项目）以及捷克共和国和匈牙利科学院之间的双边项目（MTA-16-11）的支持。

利益争夺

我们声明没有利益冲突。

参考

Gombos，Z。，Wada，H。和Murata，N。（1994）。膜脂质的不饱和度加速了低温光抑制对光合作用的恢复：一种机制令人不寒而栗。 Proc Natl Acad Sci USA 91（19）：8787-8791。
Komenda，J。和Barber，J。（1995）。 Synechocystis PCC 6803的psbO和psbH缺失突变体的比较表明降解D1蛋白受QB位点调节并依赖于蛋白质合成。 Biochemistry 34（29）：9625-9631。
Rippka，R.，Deruelles，J.，Waterbury，J.B.，Herdman，M。和Stanier，R。Y.（1979）。蓝细菌纯培养物的一般分配，菌株历史和特性。微生物学 111：1-61。
Shen，G.，Boussiba，S。和Vermaas，W。F.（1993）。 Synechocystis sp PCC 6803菌株缺乏光系统I和藻胆体功能。植物细胞 5（12）：1853-1863。
Tichý，M.，Beckova，M.，Kopecna，J.，Noda，J.，Sobotka，R。和Komenda，J。（2016）。 Synechocystis 的菌株 PCC 6803与光系统II的异常组装包含串联重复大型染色体区域。 Front Plant Sci 7：648。
Wellburn，A.R。（1994）。叶绿素a和b以及总类胡萝卜素的光谱测定，使用各种溶剂和分光光度计不同的分辨率。 J Plant Physiol 144（3）：307-313。
Wittig，I.，Karas，M。和Schagger，H。（2007）。高分辨率透明天然电泳，用于凝胶功能测定和膜蛋白复合物的荧光研究。 Mol Cell Proteomics 6（7）：1215-1225。