材料和试剂

注意：以下材料用于确定NK细胞的活化和功能。

移液器吸头
10 ml Dispovan注射器（BD，目录号：301001）
10毫升Vacutainer肝素管（BD，目录号：367880）
尼龙网孔过滤器100微米（BD，Pharmingen，目录号：352360）
尼龙网格过滤器40微米（BD，Pharmingen，目录号：352340）
15 ml离心管（BD，Pharmingen，目录号：352096）
50 ml离心管（BD，Pharmingen，目录号：352070）
48孔细胞培养群（Corning，目录号：3548）
75 cm 2 细胞培养瓶（Corning，目录号：430720）
5毫升圆底管（BD，Pharmingen，目录号：352054）
Ficoll-Hypaque，ρ= 1.077 g / ml（Sigma-Aldrich，目录号：10771）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）1x（HiMedia Laboratories，目录号：023）＆nbsp;
台盼蓝溶液（Sigma-Aldrich，目录号：T8154）
CD3 / PE-Cy7 1：100（BD，Pharmingen，目录号：563423）
CD56 / V450 1：200（BD，Pharmingen，目录号：560360）
CD45 / APC 1：100（BD，Pharmingen，目录号：555485）
EpCAM抗体1:50（艾博抗（上海）贸易有限公司，目录号：ab46714）
HLA I / FITC 1：100（BD，Pharmingen，目录号：555555）
HLA II类/ FITC 1：100（BD，Pharmingen，目录号：565558）
RPMI-1640培养基（Thermo Fisher Scientific，目录号：11875093）
ITS液体培养基补充剂（100x）（Sigma-Aldrich，目录号：13146）
人血清白蛋白（HSA）10 mg / ml（Sigma-Aldrich，目录号：12055-091）
表皮生长因子（EGF）20 mg / ml（Sigma-Aldrich，目录号：E9644-2MG）
IL10 ELISA试剂盒（Pepro Tech Worldwide，目录号：900-K21）
IFNγELISA（Pepro Tech Worldwide，目录号：900-K27）
碘化丙啶（PI）5μg/ 100 ml（Sigma-Aldrich，目录号：P4864-10ML）
柠檬酸盐葡萄糖右旋糖（CPD）0.25 mM（Sigma-Aldrich，目录号：C7165）
99.9％乙醇（Analytical CS Reagent，目录号：1170）
完全中等（见食谱）

设备

移液器
流式细胞仪（FACSAriaIII，BD Sciences，San Jones，CA）
ELISA阅读器（BioTEK，型号：PowerWave Elite XS）
CO 2 培养箱（NuAire，型号：Nu4750）
冷冻离心机（Eppendorf，型号：5810R）
生物安全柜（ESCO，型号：II级，A2型）
倒置显微镜（奥林巴斯，型号：CK2）
血细胞计数器（Sigma-Aldrich，目录号：Z359629）
移液管10μl，100μl，200μl和1,000μl（Eppendorf）
-80°C冰箱（Thermo Scientific，型号：Forma TM 900系列）
4°C冰箱（惠而浦，型号：FF-350 Elite）

软件

BD FACSDiva TM 软件（BD，Pharmingen，San Jones，CA）（已用于分析基于流式细胞术的实验的数据）
所有统计分析均基于GraphPad Prism 5.01（GraphPad Software，La Jolla，CA）

程序

整个方案分为5个部分：（A）健康供体的NK细胞的制备; （B）从卵巢癌患者的腹水中制备纯化的肿瘤细胞; （C）NK和肿瘤细胞的共培养用于细胞毒性测定; （D）确定肿瘤细胞中的HLA抗原; （E）培养上清液的细胞因子分析。

健康供体NK细胞的制备
1. 从健康供体的静脉取出10ml外周血，置于10ml肝素小瓶中。用RPMI-1640培养基以1：1稀释血液。＆nbsp;
2. 将肝素化稀释的血液缓慢地覆盖在50ml塑料管中的10ml Ficoll-Hypaque上。通过密度梯度离心在600 x g 下分离单核细胞25分钟而不中断。
3. 密度梯度离心将全血分成三个成分：红细胞/粒细胞，血浆和血沉棕黄层。血沉棕黄层，薄层（原始血液体积的约1％）夹在重红细胞/粒细胞和富含血小板的血浆之间，但含有大部分单核细胞（MNC）。图1显示离心后三层的位置。尽可能多地去除等离子体层;用一次性移液管收集血沉棕黄层材料而不打扰底层。将内容物转移到新的无菌管中，在10ml培养基中洗涤样品两次，并使用台盼蓝排除法计数活细胞计数。
  
  图1.密度梯度离心后的三层外周血。顶层血浆层含有大部分血小板，中层（血沉棕黄层）由单核细胞组成，底层Ficoll层由红细胞和粒细胞组成。
4. 在3ml塑料管中取900万个单核细胞，其中加入各5μl的1:10稀释的CD3 / PE-Cy7和CD56 / V450抗体混合物。混合内容物并在4℃下孵育30分钟。
5. 用3ml PBS和含有2％人血清的培养基洗涤细胞沉淀1次，在400μg/ ml离心5分钟，最后重悬于含有2％人血清的3ml培养基中并储存于黑暗中的冰浴。＆nbsp;
6. 使用带有70μm喷嘴的FACSAriaIII进行细胞分选。在密度图（图2A）中显示了细胞的侧向散射（SSC）和前向散射（FSC）特性的点图，其分别给出了尺寸和粒度的估计。排除死细胞，细胞碎片和高粒度细胞后的潜在单核细胞。对这个门控人群进行两阶段双重鉴别（图2B和2C）。图1C中的门控人口预计不会出现任何双重或更高的总量。＆nbsp;
7. 获取点图中的数据，作为CD3 / PE-Cy7和CD56 / Horizon V450的组合，它提供预排序结果（图2D）。预分类分析显示CD3 - CD56 + 细胞约为18.5％。
8. 使用同一台机器对蓝色门控细胞（CD3 - CD56 + ）进行分类并收集到新管中。在流式细胞仪的相同设置中重新分析经过分选的细胞，以检查NK细胞的纯度。如图2E所示，落入相同门控区域内的细胞部分（如前短）表示纯度为94.4％。剩下的部分似乎是死细胞和/或碎片。
9. 在PBS中洗涤分选的细胞，并通过台盼蓝排除法计算活菌数。细胞的活力约为95％。
  
  图2. NK细胞的分选。显示了NK细胞的分选策略和分类纯度。代表性点图显示CD3 - CD56 + 细胞的分选前和分选后纯度。 A.单核细胞的侧向散射（SSC）和前向散射（FSC）特性。 B.基于细胞粒度的双重歧视。 C.基于细胞大小的双重歧视。 D. NK细胞的预分类分析。 E. NK细胞的分类后分析。
从卵巢癌患者的腹水中制备纯化的肿瘤细胞
1. 在含有CPD的无菌容器中取约200ml浆液性上皮性卵巢癌患者的腹水。通过在600 离心下离心20分钟使细胞沉淀。将细胞重悬于10ml培养基中，并按照步骤A2进行。取出含有单核细胞的血沉棕黄层，洗涤，然后在步骤A3后计算活菌数。＆nbsp;
2. 在3ml塑料管中取约5×10 6个细胞，并通过在冰浴中孵育30分钟用一抗（EpCAM和CD45 / APC）染色。在EpCAM的情况下，在添加荧光染料标记的第二抗体（抗兔/ PECy5）之后进行第二个温育步骤。按照步骤A5洗涤细胞并重悬于培养基中。
3. 按照步骤A6对两种不同表型的细胞进行分选：EpCAM + CD45 + 和EpCAM + CD45 - 。预分选和分选后细胞的点图显示在图3中。两种细胞组分的纯度和活力都超过90％。
  
  图3.肿瘤细胞分析和分选纯度。预分类点图显示卵巢癌患者腹水中存在的单核细胞的不同表型。代表性的点图（右）显示高度纯化的EpCAM + CD45 + 和EpCAM + CD45 - 细胞。
用于细胞毒性测定的NK和肿瘤细胞的共培养
1. 取一个48孔平底培养板。在多个孔中，在200μl体积的完全培养基中从步骤B3获得100,000种细胞的每种类型的癌细胞。将来自步骤A9的新鲜分离的NK细胞以1：5的比例（1份肿瘤和5份NK细胞）倒入每孔中的100μl相同培养基中。保留两组3个孔，每个孔含有肿瘤细胞作为对照，不接受NK细胞。类似地，一组孔仅包含NK细胞。
2. 将培养板在5％CO 2 培养箱中于37℃孵育24小时。将细胞悬浮液从每个孔转移至相应的标记管并在300μM离心5分钟。除去培养物上清液并储存在-80℃，用400μlPBS洗涤细胞沉淀2次。
3. 将细胞沉淀重悬于400μlPBS中，向每个管中加入1μlPI，并在黑暗中孵育1-2分钟之前轻轻混合内容物。
  注意：用手指轻轻敲打细胞混合物。细胞分析应在加入PI后5分钟内进行。
4. 以一种方式调整流式细胞仪的设置，使得基于物理性质（大小和粒度），可以从NK细胞划分肿瘤细胞。因此，两类细胞形成两个主要的簇。由于粒度低，NK细胞保留在FSC-SSC点图的底部（图4A）。对这个门控群体进行两阶段双重鉴别，然后在PI - 细胞的基础上分析生存力。 SSC与PI强度的直方图显示仅2％的细胞死亡（图4D）。
  
  图4. NK细胞的孵育后活力。代表性点图显示了孵育24小时后PI细胞的NK细胞和直方图谱的策略。 A. NK细胞的侧向散射（SSC）和前向散射（FSC）特性。 B.基于细胞粒度的双重歧视。 C.基于细胞大小的双重歧视。 D. PI染色的死细胞的直方图分析。
5. 仅在EpCAM + CD45 + 细胞的情况下（对照）的类似分析显示NK细胞在不同位置的聚集体比其他细胞/细胞片段（图5A和5C）。双重区分后，对照细胞的活力为6.8％（图5B）。在与NK细胞的共培养中，EpCAM + CD45 + 细胞的活力略微增加至9.8％（图5D）。
  
  图5. NK细胞介导EpCAM + CD45 + 肿瘤细胞的死亡。代表性直方图显示，与对照（无NK细胞）相比，测试样品中EpCAM + CD45 +细胞的死亡没有增加。 A.NK（对照）和肿瘤细胞混合物的侧向散射（SSC）和前向散射（FSC）特性。 B. PI染色的死细胞的直方图分析。 C.NK（测试）和肿瘤细胞混合物的侧向散射（SSC）和前向散射（FSC）特性。 D. PI染色的死细胞的直方图分析。
6. 当在相同条件下与NK细胞共培养时，EpCAM + CD45 - 细胞显示死细胞从4.8％急剧增加至26.8％（图6B和6D）。
  
  图6. NK细胞介导EpCAM + CD45 - 肿瘤细胞的死亡。代表性直方图显示，与对照（无NK细胞）相比，测试样品中EpCAM + CD45-细胞显着死亡。 A.NK（对照）和肿瘤细胞混合物的侧向散射（SSC）和前向散射（FSC）特性。 B. PI染色的死细胞的直方图分析。 C.NK（测试）和肿瘤细胞混合物的侧向散射（SSC）和前向散射（FSC）特性。 D. PI染色的死细胞的直方图分析。
7. NK细胞对肿瘤细胞的两个部分的相对杀伤作用显示在图7中。
  
  图7. NK细胞介导的肿瘤细胞死亡的统计分析。显示NK细胞介导的肿瘤细胞死亡。条形图显示死细胞的比较值。在分选的EpCAM + CD45 - 细胞的情况下，观察到显着高的细胞死亡。误差线表示平均值±SD（n = 5）。根据学生的 t - 测试计算显着性。
肿瘤细胞中HLA抗原的测定
为了证实NK细胞敏感的肿瘤细胞部分（EpCAM + CD45 - ）实际上下调了HLA I类抗原的表达而不是不敏感的细胞（EpCAM + CD45 + ），在步骤B3之后分别用HLA I类和II类抗原染色细胞级分。在EpCAM + CD45 - 细胞中，两种HLA抗原的表达均显着下降，在EpCAM + CD45 +中保持高水平表达细胞（图8）。

图8.HTC I类和II类抗原在EpCAM + CD45 + 和EpCAM + CD45 - <的比较表达/ sup>细胞。 A.代表性的点图显示两种类型的抗原在EpCAM + CD45 + 细胞中高度表达，而它们显着下降在EpCAM + CD45 - 隔室中。 B.肿瘤细胞中HLA I类和II类抗原表达的统计学分析。条形图显示两种细胞部分的比较值。误差线表示平均值±SD（n = 5）。统计意义是根据学生的 t - 测试来计算的。
细胞因子分析培养上清液
使用试剂盒中所述的标准方案，通过ELISA检查步骤C2中存储的培养物上清液。测定不同稀释度（1：1,1：5,1：10）的上清液中IFNγ和IL-10的存在。结果证实，当EpCAM + CD45 - 和NK细胞时，培养上清液中存在两种细胞因子（使用浓度均落在校准曲线线性范围内的稀释液）一起孵化（图9A和9B）。

图9. NK细胞的激活。：一种。 IFNα在腹水（AF）和步骤C2的共培养基中的浓度。 B.腹水（AF）和步骤C2的共培养基中IL-10的浓度。误差线表示平均值±SD（n = 4）。基于学生 t - 测试的统计显着性。

数据分析

该方案的概念是证明一种全面的方法，并证实健康供体的NK细胞识别下调HLA I类抗原的肿瘤细胞，进而自我激活并杀死已识别的细胞（Akhter et al。，2018）。如图6所示，EpCAM + CD45 - 细胞在24小时内遭受高死亡（30.54±3.18％， P <0.0007）。与对照相比的培养（图7）。此外，该方案确保在识别肿瘤细胞后，NK细胞被激活并分泌高水平的IFNγ（1487±68pg / ml， P <0.0001）和IL-10（345±28pg）。与对照（图9A和9B）相比，/ ml， P <0.0001）。因此，该方案提供了一种非放射性，基于流式细胞术的方法，可以在实验室中轻松采用以产生大量信息：a）患者NK细胞和健康供体来源的功能评估，b）确认其对肿瘤的特异性识别细胞，和c）确定NK细胞的自激活。

食谱

完整媒体
RPMI-1640补充10 mg HSA / ml，1x ITS和20 ng / ml EGF

致谢

我们感谢印度政府生物技术部（DBT）对该研究所分子医学中心项目的慷慨支持。

利益争夺

作者没有利益冲突。

伦理

在敲击期间，根据患者的知情同意，从印度新德里的全印度医学科学院（AIIMS）的肿瘤内科获得样品。该项目是在AIIMS（IEC / NP-277 / 01-08-2014）和NII（HEC / XX / 2014）的道德委员会的适当批准下进行的。样品按照批准的程序处理。

参考

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