材料和试剂

移液器吸头（Axygen Scientific，目录号：T-200-Y）
1.5毫升翻盖管（Axygen Scientific，目录号：MCT-150-C）
塑料薄膜（Greiner多孔板密封剂，Sigma-Aldrich，目录号：A5596）
硼硅酸盐玻璃珠，5 mm（Sigma-Aldrich，目录号：Z143944）
96孔平底板（Costar，目录号：3596）＆nbsp;
巴比妥补充稀释剂片（Oxoid，目录号：BR0016）
NaOH颗粒（UNIVAR，目录号：A482）
浓HCl（ANALAR，目录号：101256J）
人体血清（HuS），非热灭活，储存于-20°C（根据南阿德莱德当地卫生网络，人类伦理研究委员会批准＃343.16-HREC / 16 / SAC / 306，按照常规临床表现从废弃血液中采集））
新鲜采集的兔血（弗林德斯大学动物福利委员会批准使用清除材料）
纯化的FH，由人体血液内部产生并储存在-20°C [使用前在载体中稀释至1μg/μl（Cabezas et al。，2018）]
车辆=测试样品的相应载体，例如DMEM（Hyclone，目录号：SH30022.01）
氯化钠（NaCl）（Santa Cruz，目录号：sc-203274A）
明胶溶液（2％溶液）（Sigma-Aldrich，目录号：G1393）
EGTA（西格玛奥德里奇，目录号：E3889）
Veronal缓冲液（见食谱）
AP缓冲区（见食谱）
盐水（见食谱）
10 N NaOH（见食谱）

设备

移液器（Thermo Fisher Scientific，型号：Finnpipette F1）
50-100毫升锥形瓶/锥形瓶（Thermo Fisher Scientific，目录号：KIM 265520-1）
烤箱（Labnet迷你孵化器）
血细胞计数器（计数室）（Hawksley，目录号：AC1000）
平板离心机（Heraeus Sepatech Omnifuge 2.0 RS）
微孔板读板机（多模探测器）（Beckman Coulter，型号：DTX880）

程序

兔RBC的制备
注意：所有程序均在标准实验室工作台上进行。
1. 将兔血收集到含有一层玻璃珠的50-100ml烧瓶中并轻轻旋转以形成凝块。这应该在10分钟内完成，并在大约20分钟内完成。
2. 滗出去纤维血。让细胞在重力作用下沉降2-5分钟。弃去上清液并在约25ml AP缓冲液中洗涤。起始溶液为红色，然后在洗涤后变得澄清。一旦最终的无细胞上清液澄清（通常在3-4次洗涤后），细胞就可以使用了。储存在4°C直至使用（最长1-2个月）。
3. 使用前，在约25 ml AP缓冲液中重新洗涤RBC。
4. 使用血细胞计数器计数细胞，并用AP缓冲液调节至5×10 5个/ ml细胞/ ml。
分析方法
1. 使用AP缓冲液稀释HuS，2比5，以螯合钙并使CP和LP失活，产生40％的HuS原液。例如;在1.5 ml管中加入720μlAP缓冲液至480μlHuS。＆nbsp;
2. 在冰上孵育15分钟。
3. 在1.5 ml翻盖管中，将40％HuS与测试物质和AP缓冲液混合，总体积为100μl。对于每个测试样品，包括0％，5％和10％HuS的最终浓度的HuS。对照组仅包括0％，5％和10％的HuS。包括0,5％和10％HuS与50μg纯化的FH，作为负调节剂（抑制）对照。应使用合适的载体即将体积重建至100μl，该培养基对应于测试样品，例如DMEM或RPMI。样品设置如表1所示。
  注意：每种测试样品的最终浓度均为5％和10％的HuS，以确保活性既不饱和也不在检测极限，因此可以测量AP的活化剂和抑制剂。
  
  表1.测试样品和对照的管组件
4. 如果需要，将来自步骤B3的50μl每种样品混合物加入96孔板中，一式两份或一式三份。
5. 加入50μl如上程序A中制备的RBC悬浮液。包括总溶血对照（50μl细胞+50μl水）。样品设置的一个例子如图2A所示。
  
  图2.示例数据。：一种。分析板设置。红色=单独使用HuS控制;蓝色= HS + FH抑制对照;绿色=测试样品1-8;粉红色= 100％溶血;紫色=空白对照灰色=井空。 B. OD测量。 C.示例计算。
6. 用塑料薄膜密封板，在37°C的烘箱中孵育30分钟，每10分钟轻轻摇动一次。
7. 向除100％溶血对照外的所有孔中加入150μl冰冷的盐水缓冲液。
8. 旋转板，1,000 x g ，5分钟。
9. 用移液管小心取出100μl澄清的上清液，转移到新的平底96孔板中，注意不要打扰沉淀的红细胞。
10. 读取405nm处的吸光度，得到图2B中所示的OD值的示例范围。
  注意：多通道移液器可用于步骤B5，B7和B9。

数据分析

对于100％裂解和空白，平均OD 405 值。
对于每个孔，使用图2C中所示的等式计算％裂解。
计算测试一式三份的平均％裂解值±SD。
确认对照是否恰当：单独使用0％，5％和10％的HuS（应显示增加的溶解能力）; HuS + FH（抑制）; 0％HuS +测试（单独测试样品的溶解能力）。
确定重要性 P ＆lt; 0.05（例如，由学生的 t - 测试[一个变量]或单向ANOVA / Tukey测试[多个变量]），与使用适当的％HuS单独控制相比GraphPad棱镜。

食谱

Veronal缓冲区
将一种巴比妥补充稀释剂片剂溶于100ml温水中并在室温下储存
注意：用于制造AP缓冲液的Veronal缓冲液含有barbitone，这是一种麻醉药。确保缓冲液和试剂按照规定储存。
AP缓冲区
Veronal缓冲液加0.01 M EGTA和0.1％（w / v）明胶，pH 7.5
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：400px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>最后的决定。
1升
0.01 M EGTA
3.80克
0.1％（w / v）明胶
200毫升2％明胶溶液
1. 煮沸溶液，通过微波溶解以溶解明胶
2. 加入EGTA并通过逐滴加入10N NaOH将pH调节至8-8.5以溶解EGTA。一旦溶液澄清，然后加入浓HCl以将最终pH调节至7.5
3. 过滤消毒以防止微生物生长
盐水＆nbsp;
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：200px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>最后的决定。
1升
0.15 M NaCl
8.76克
10 N NaOH
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：200px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>最后的决定。
1升
10 N
400克

注意：所有缓冲液均由MilliQ水中补充。

致谢

Cabezas-Falcon女士获得澳大利亚国际研究生研究奖学金。

利益争夺

作者没有利益冲突或利益冲突。

伦理

根据南阿德莱德临床人类研究伦理委员会（SA HREC EC00188），ORF编号343.16的批准收集人血清。根据弗林德斯大学动物福利委员会的批准收集羊血，以使用清除材料。

参考

Blom，AM，Volokhina，EB，Fransson，V.，Stromberg，P.，Berghard，L.，Viktorelius，M.，Mollnes，TE，Lopez-Trascasa，M.，van den Heuvel，LP，Goodship，TH，Marchbank ，KJ和Okroj，M。（2014年）。直接测量人血清中补体转化酶活性的新方法。 Clin Exp Immunol 178（1）：142-153。＆nbsp;
Cabezas，S.，Bracho，G.，Aloia，A.L.，Adamson，P.J.，Bonder，C.S.，Smith，J.R.，Gordon，D.L。和Carr，J.M。（2018）。登革病毒诱导受感染细胞中补体替代途径的活性增加。 J Virol 92（14）。＆nbsp;
Joiner，K.A.，Hawiger，A。和Gelfand，J.A。（1983）。对人类替代补体途径测定的最佳反应条件的研究。 Am J Clin Pathol 79（1）：65-72。＆nbsp;
Prohaszka，Z.，Nilsson，B.，Frazer-Abel，A。和Kirschfink，M。（2016）。 2016年补体分析：临床适应症，实验室诊断和质量控制。免疫生物学 221（11）：1247-1258。＆nbsp;
Ricklin，D.，Hajishengallis，G.，Yang，K。和Lambris，J。D.（2010）。补充：免疫监测和体内平衡的关键系统。 Nat Immunol < / em> 11（9）：785-797。