材料和试剂

10μl，200μl或1,000μl吸头（Fukae-Kasei，Watson，目录号：123R-254CS，123R-755CS，110-706C）
200μl凝胶加载技巧（Quality Scientific Plastics，目录号：010-Q）
5毫升或10毫升移液器（康宁，目录号：4487,4488）
50毫升锥形离心管（BD，Falcon，目录号：352070）
1.5 ml微量离心管（Ina Optika，BIO-BIK，目录号：CF-0150）
35毫米或100毫米培养皿（康宁，目录号：430165,430167）＆nbsp;
6孔板（康宁，目录号：3516）＆nbsp;
35毫米玻璃底培养皿（MatTek，目录号：P35G-0-14-C）
0.22μm注射式过滤器（Millipore，目录号：SLGVJ13SL）
Kimwipes（Nippon Paper Crecias，目录号：62011）
铝箔（三菱铝，Nippaku箔）
超速离心厚壁聚碳酸酯管（Beckman Coulter，目录号：349622）
HeLa细胞（RIKEN细胞库，目录号：RCB0007）
MDA-MB-231细胞（ATCC，目录号：HTB-26）
Dulbecco的改良Eagle培养基（DMEM），高葡萄糖，含L-谷氨酰胺和酚红（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号：044-29765）
胎牛血清（FBS）（Biowest，目录号：S1820）
青霉素 - 链霉素混合溶液（P / S）（NACALAI TESQUE，目录号：09367-34）
胰蛋白酶-EDTA溶液与酚红（NACALAI TESQUE，目录号：32778-34）＆nbsp;
FuGENE HD转染试剂（Promega，目录号：E2311）
Opti-MEM，降低血清培养基（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：31985070）
无细胞外囊泡的胎牛血清（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：A2720803）
总外泌体分离试剂（来自细胞培养基）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：4478359）
多聚甲醛（PFA）粉末（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
正常山羊血清（Jackson Immuno Research，目录号：005-000-121）
亲脂示踪剂，DiD（Ex.644 nm; Em.665 nm）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：D7757）
Biotinyl Cap PE（PE-biotin）（Avanti Polar Lipids，目录号：870277）
生物素结合的牛血清白蛋白（BSA-生物素）（Sigma-Aldrich，目录号：A8549）
牛血清白蛋白（BSA）（西格玛奥德里奇，目录号：A8022）
链霉抗生物素蛋白（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：434301）
货物抗体（例如，抗cMET抗体; Cell Signaling，目录号：3127S）
二抗（例如，抗小鼠IgG Alexa Fluor 594; Cell Signaling，目录号：8890S）
货物的质粒DNA（例如，构建GFP-或mCherry-融合货物蛋白的质粒DNA）
氯化钠（NaCl）（NACALAI TESQUE，目录号：31319-45）
氯化钾（KCl）（Wako，目录号：163-03545）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 ）（NACALAI TESQUE，目录号：31723-35）
磷酸二氢钾（KH2 2 PO 4 ）（NACALAI TESQUE，目录号：28721-55）
NaOH（NACALAI TESQUE，目录号：31511-05）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）
4％PFA（见食谱）

设备

玻璃小瓶（Maruemu，目录号：5-115-02）
钳子
移液器（Gilson，型号：PIPETMAN P10，P20，P200，P1000）
移液器（Drummond Scientific，型号：Pipet-Aid XP）
聚丙烯微管收纳架，80个位置
试管架（Sanwakaken，目录号：SS30-10）
清洁罩（NK系统，型号：VH-1300BH-2A）
CO 2 培养箱（Forma Scientific，型号：3158）
共聚焦激光扫描显微镜（Zeiss，型号：LSM 510 Meta）
透射光显微镜（奥林巴斯，型号：IMT-2）
超速离心机（Beckman Coulter，型号：Optima TL）
超速离心机转子（Beckman Coulter，型号：TLA-100.3）
冷冻微量离心机（Tomy Seiko，型号：MRX-151）
涡旋混合器（科学工业，型号：Vortex-Genie 2）
冰箱，4°C
-20°C冷藏柜
寒冷的房间，4°C

软件

LSM510 v4.2操作软件（蔡司）
ImageJ（ https://imagej.nih.gov/ij/ ）
Excel for Mac 2011（微软）

程序

整体程序
分析单细胞外囊泡货物密度的总体程序如图1所示。

图1.检测单细胞外囊泡中货物密度的总体程序
细胞外囊泡的产生和纯化
1. 细胞培养和转染产生释放的细胞外囊泡
  1. 将HeLa细胞或MDA-MB-231细胞接种到35mm培养皿或6孔板上，并保持在含有10％胎牛血清（FBS）和1％青霉素/链霉素（P / S）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中。）在37°C，5％CO 2 。＆nbsp;
  2. 当细胞达到70％汇合时，取出培养基并用2ml不含FBS和P / S的37℃DMEM洗涤细胞2次。
  3. 用含有10％无细胞外囊泡的胎牛血清和1％P / S的1.2ml 37℃DMEM替换培养基。
  4. 在37°C，5％CO 2 中孵育24至48小时。＆nbsp;
  注意：在分析外源性货物（例如，GFP-或mCherry融合蛋白）的情况下，需要使用基于脂质的转染进行瞬时转染试剂（例如，FuGENE HD）在用无细胞外囊泡的培养基替换前24至48小时。
2. 细胞外囊泡的纯化
  1. 该部分的流程图如图2所示。
    
    图2.通过差速离心分离细胞外囊泡（外泌体和微泡）的流程图
  2. 将来自90％-95％汇合细胞的细胞培养基（1.2ml）收集在1.5ml微量离心管中。
  3. 使用冷冻微量离心机在4℃下以500×g离心10分钟离心以除去细胞碎片。
  4. 收集所有1.2ml上清液并转移至新的1.5ml微量离心管中。
  5. 使用冷冻微量离心机在4℃下以12,000 x g 离心20分钟以分离微泡等。
  6. 收集上层1ml上清液，通过0.22μm孔径过滤器过滤直接纯化，并转移到超速离心机厚壁聚碳酸酯管中。过滤后大约70μl样品丢失。
  7. 将来自步骤B2e的沉淀物稀释于200μl磷酸盐缓冲盐水（PBS）（富含微泡的部分）中。
  8. 使用超速离心机（Optima TL，转子：TLA-100.3）在100,000℃ x g 4℃下超滤离心过滤的上清液70分钟。＆nbsp;
  9. 小心地去除上清液（约930μl）。
  10. 将沉淀物稀释在200μlPBS（富含外泌体的部分）中。
  注意：根据制造商的说明，可以使用总外泌体分离试剂纯化外泌体。
功能化玻璃表面的制备
1. 该部分的流程图如图3所示
  
  图3.功能化玻璃表面的制备流程图
2. 制备BSA / BSA-生物素混合物，在490μlPBS中混合5μl10M BSA和5μl1M BSA-生物素。＆nbsp;
3. 用400μlBSA/ BSA-生物素混合物覆盖玻璃底35mm培养皿的玻璃表面。
4. 在室温下孵育20-30分钟。
5. 通过在312μlPBS中稀释8μl1M链霉抗生物素蛋白制备25mM链霉抗生物素蛋白溶液。＆nbsp;
6. 用1 ml PBS轻轻冲洗玻璃表面一次，去除多余的BSA / BSA-生物素。
7. 用300μl链霉抗生物素蛋白溶液覆盖玻璃表面。
8. 在室温下孵育10分钟。
9. 用1 ml PBS轻轻冲洗BSA / BSA-生物素/链霉抗生物素蛋白涂层玻璃表面两次。
细胞外囊泡的标记
1. 将分离的细胞外囊泡（总共200μl）转移到玻璃小瓶中。
2. 将2μl10mg/ ml DOPE-生物素加入玻璃小瓶中并悬浮混合。
3. 在室温下孵育5分钟。
4. 将2μl的1 mg / ml DiD加入玻璃瓶中并悬浮混合。
  注意：由于DiD染色是计算货物密度的最关键步骤，因此准确计算DiD值非常重要。
5. 在室温下将玻璃瓶在50ml锥形管中在200 x g 下旋转，并用镊子将其取出。
6. 然后在室温下在黑暗中孵育15分钟（图4）。
  
  图4.在玻璃瓶中用DOPE-生物素和DiD标记细胞外囊泡
细胞外囊泡在玻璃表面的固定化
1. 使用凝胶加载长尖端将DOPE-生物素和DiD标记的细胞外囊泡施加到功能化玻璃表面上（图5）。
  
  图5.细胞外囊泡在功能化玻璃表面上的固定化。 DOPE-生物素和DiD标记的细胞外囊泡溶液应用于功能化玻璃表面，使其平坦抵抗表面张力。
2. 在黑暗条件下，在4°C下静置2-3小时。
3. 用2ml PBS冲洗两次。
注意：如果分析瞬时表达的外源性货物（例如，GFP-或mCherry融合蛋白），请立即跳至“（G）成像”。
细胞外囊泡内源性货物的免疫荧光染色
1. 在黑暗条件下用4％PFA固定固定的细胞外囊泡5分钟。
2. 用2ml PBS冲洗细胞外囊泡两次，并移出所有溶液。
3. 加入150μl含有10％正常山羊血清的PBS，在室温下在黑暗条件下孵育30分钟。
4. 用2ml PBS冲洗细胞外囊泡一次，并移出所有溶液。
5. 在PBS中加入150μl抗货物抗体（例如，抗-cMet抗体），在室温下在黑暗条件下孵育60-90分钟。
6. 用PBS冲洗细胞外囊泡一次并移出所有溶液。
7. 在PBS中加入150μl荧光染料缀合的二抗（例如，Alexa 488或Alexa 594），并在室温下在黑暗条件下孵育30分钟。
8. 用2ml PBS冲洗细胞外囊泡两次。
9. 在4°C的黑暗条件下保存，并在2-3天内观察。
使用荧光显微镜成像荧光标记的货物和DiD
注意：对于这个成像部分，我们将展示外泌体样本作为代表。
1. 打开共聚焦激光扫描显微镜（Zeiss，LSM 510 Meta）。
2. 打开Zeiss LSM510 v4.2操作软件。
3. 打开适当的激光（例如，氩激光用于激发GFP或Alexa 488,543纳米波长He-Ne激光用于激发mCherry或Alexa 594,633 nm波长He-Ne激光用于激发DID）。
4. 选择63x物镜。
5. 将玻璃底部35mm培养皿与固定的和货物标记的细胞外囊泡放在样品架上。
6. 在目镜观察下使用可见光仔细查找玻璃表面。
7. 将观察状态更改为激光扫描。
8. 在“扫描控制面板”，“模式”中，将缩放级别设置为x1（默认）。
9. 在“扫描控制面板”，“通道”中，将针孔设置为“200”。＆nbsp;
10. 使用“快速XY”通过DiD通道调整焦距。
11. 收集DiD和荧光货物（例如，GFP-或mCherry-融合货物或具有反 - 的免疫染色货物的平均图像（例如，数字选择为4的平均值）小鼠IgG Alexa 488或抗小鼠IgG Alexa 594作为二抗）并将其保存为lsm格式。＆nbsp;
12. 获得的外泌体图像显示在图6中（在内源性货物的情况下）或Kajimoto 等人（2013）或（2018）（在外源GFP-或mCherry-融合货物的情况下）。
  
  图6.单外泌体中货物（cMet-Alexa 594）和DiD的荧光图像。 MDA-MB-231细胞释放的外泌体用抗cMet抗体染色，Alexa 594二抗和DiD 。比例尺，10μm。

数据分析

打开ImageJ软件。
转到“调整”→“设置测量”，选中“区域”，“平均灰度值”和“集成密度”，然后单击“确定”按钮。
打开采集的图像（lsm格式文件，此处使用图6中的数据作为示例），拖放到ImageJ图标（图7A）。
选择DiD图像（通道2）（图7B）。
设置“图像”→“类型”→“8位”并确认图像转换为灰度（图7C）。
设置“编辑”→“反转”→“否（针对问题”处理所有3个图像？“）”以反转DiD图像（图7D）。
使用“图像”→“调整”→“阈值”突出显示细胞外囊泡（图7E）。基本上使用“自动”将运作良好。如有必要，将阈值调整到适当的水平以进行计数。
转到“分析”→“分析粒子”。 “Analyze Particles”窗口中有一些选项（图7F）。基本上使用默认设置（大小：0-Infinity，圆度：0.00-1.00，显示：无），只需选中“显示结果”和“添加到管理器”。如果有太多小噪音，或者您想根据大小排除粒子，请调整“大小”的数量。＆nbsp;

图7.用ImageJ 计算获得的货物图像（cMet-Alexa 594）和DiD的转换
在“ROI Manager”窗口中，转到“More”→“Multi Measure”，然后选中“Measure All 2 Slices”并单击“Ok”按钮。
得到每个细胞外囊泡的货物（在通道1中）和DiD（在通道2中）的“面积”，“平均灰度值（平均值）”和“综合密度（IntDen）”信息（图8）。

图8.通过ImageJ定量的每个外泌体中货物（cMet-Alexa 594）和DiD的“面积”，“平均灰度值（平均值）”和“综合密度（IntDen）”的结果。在该图像中分析的外泌体总数为122.
通过复制和粘贴将数据集传输到Excel。
分别获得货物和DiD通道背景的“平均灰度值（平均值）”信息。
1. 再次打开采集的图像。
2. 使用“矩形”或“椭圆形”工具选择无囊泡的暗区。＆nbsp;
3. 转到“分析”→“测量”，获得货物和DiD通道的“区域”，“平均灰度值（平均值）”和“综合密度（IntDen）”信息。
4. 通过复制和粘贴将数据集传输到Excel。
分别计算每个细胞外囊泡的货物背景和DiD。
计算公式：背景=（背景的“平均灰度值[平均值]”）*（细胞外囊泡的“面积”）
注意：如果计算结果小于零“0”，则将其固定为零“0”。该负值意味着无法检测到货物或DiD。
计算每个细胞外囊泡的货物密度。
计算公式：
货物密度= [（货物的“综合密度（IntDen）”） - （货物背景）] / [（DiD的“综合密度（IntDen）” - （（DiD背景）]
然后根据研究目的进行不同的演示，如Kajimoto et al。（2013）或（2018）。

笔记

该方案适用于所有样品，包括贴壁细胞和非粘附细胞，血浆和组织。我们使用贴壁细胞作为例子来描述详细的方案。
细胞外囊泡的量在不同细胞类型中变化。在大多数情况下，35毫米培养皿或6孔培养皿中的小规模培养就足够了，但在某些情况下，需要在60毫米或100毫米培养皿中进行大规模培养。
如果使用尺寸和密度依赖的纯化方法进行细胞外囊泡如差速离心，重要的是使用健康细胞来避免细胞凋亡或细胞碎片的污染。
程序C，D和E的详细条件基本上是根据先前报道的基于荧光的测定单脂质体的测定（Hatzakis et al。，2009）。

食谱

磷酸盐缓冲盐水（PBS）
1. 混合1.37 M NaCl，27 mM KCl，100 mM Na 2 HPO 4 和18 mM KH 2 PO 4 在900毫升H 2 O中
2. 调整至最终pH 7.4
3. 将H 2 O加入1,000 ml
4. 高压灭菌器存储（这是10倍PBS库存）
5. 用H 2 O稀释1:10，制成1x PBS＆nbsp;
4％PFA
1. 在50ml锥形管中制备30ml H 2 O并加热至60℃
2. 在通风橱中60℃的30ml H 2 O中加入1.6g PFA粉末并充分混合
3. 加入4μl10N NaOH并充分混合直至溶液澄清
4. 加入4毫升10倍PBS
5. 将H 2 O加入40ml并混合
6. 冷却，在4°C的黑暗条件下储存，并在两周内使用

致谢

该方案改编自Kajimoto et al。（2013）和（2018）中公布的程序。这项工作得到了JSPS KAKENHI，上原纪念基金会，大阪医学研究基金会和中谷基金会的资助。

利益争夺

没有利益上的冲突。

参考

Hatzakis，N.S。，Bhatia，V。K.，Larsen，J.，Madsen，K.L。，Bolinger，P。Y.，Kunding，A。H.，Castillo，J.，Gether，U。，Hedegard，P。和Stamou，D。（2009）。弯曲膜如何招募两亲性螺旋和蛋白质锚定基序。 Nat Chem Biol 5（11）：835-841。
Kajimoto，T.，Okada，T.，Miya，S.，Zhang，L。和Nakamura，S。（2013）。正在进行的鞘氨醇1-磷酸受体激活介导外泌体多囊泡内体的成熟。 Nat Commun 4：2712。
Kajimoto，T.，Mohamed，N.N.I。，Badawy，S.M.M.，Matovelo，S.A.，Hirase，M.，Nakamura，S.，Yoshida，D.，Okada，T.，Ijuin，T。和Nakamura，S.I。（2018）。在F-肌动蛋白形成和货物的多泡内体上参与Gi蛋白的Gbetagamma亚基与S1P受体的参与分类到外泌体中。 J Biol Chem 293（1）：245-253。
Karpman，D.，Stahl，A。L.和Arvidsson，I。（2017）。肾脏疾病中的细胞外囊泡。 Nat Rev Nephrol 13 （9）：545-562。
Maas，S.L。N.，Breakefield，X。O.和Weaver，A。M.（2017）。细胞外囊泡：独特的细胞间递送载体。 Trends Cell Biol 27（3）：172-188。
Trajkovic，K.，Hsu，C.，Chiantia，S.，Rajendran，L.，Wenzel，D.，Wieland，F.，Schwille，P.，Brugger，B。和Simons，M。（2008）。神经酰胺引发外泌体囊泡出现在多囊泡内体中。 Science 319（5867）：1244-1247。
van Niel，G.，D'Angelo，G。和Raposo，G。（2018）。揭示细胞外囊泡的细胞生物学。 Nat Rev Mol Cell Biol 19（4）：213-228。