材料和试剂

移液器吸头
SnakeSkin TM 透析管，10K MWCO，22 mm（Thermo Fisher，目录号：68100）
Corning ® Costar ® 96孔细胞培养板（Sigma，目录号：CLS3595）
Greiner 96孔板，聚丙烯，黑色聚丙烯井平底（Sigma，目录号：M9685）
HiPrep TM 16/60 Sephacryl S-300 HR（GE Healthcare，目录号：17116701）
Nalgene Oak Ridge高速PPCO离心管（Thermo Scientific，目录号：3119-0050）
薄壁聚丙烯管（Beckman Coulter，目录号：326819）
瓶组件，聚碳酸酯，用于45Ti转子（Beckman Coulter，目录号：355622）
6-384孔板＆nbsp;
兔肌肉丙酮粉（Pel-Freez，USA，目录号：41995）（储存温度：-20°C或以下）
芘标记的肌动蛋白（Cytoskeleton，Inc，目录号：AP05-A）（储存温度：-80°C）
Tris，ULTRA PURE（MP Biomedicals，目录号：4819623）
ATP（MP Biomedicals，目录号：210000810）
DTT（黄金生物技术，目录号：DTT50）
氯化钙（CaCl 2 ）（Sigma，目录号：746495-100G）
氯化钾（KCl）（Sigma，目录号：P9541-1KG）
氯化镁（MgCl 2 ）（Nacalai Tesque，目录号：20908-65）
EGTA（VWR，目录号：VWRC0732-100G）
HCl（Sigma，目录号：320331）
没有CaCl 2 的100x G缓冲液（见食谱）
1x G缓冲液（见食谱）
10倍KME（见食谱）
F缓冲区（见食谱）

设备

移液器
烧杯（Schott-Duran，目录号：SCOT211063604（E））
超速离心机Optima XE（Beckman Coulter，型号：Optima TM XE）
JA25.50转子（Beckman Coulter，型号：JA-25.50）
Ti50.2转子（Beckman Coulter，型号：50.2 Ti型）
Ti55转子（Beckman Coulter，型号：SW 55 Ti）
ÄKTApurifier（美国通用电气医疗集团）
荧光分光光度计Cytation 5（BioTek，USA）
砂浆和杵（当地市场）
均质器（VWR，目录号：VWRI432-0208）
抹刀（当地市场）
用于中小批量应用的超声波处理器（Sonics＆amp; Materials，INC。目录号：VCX 750）
冰柜

软件

Origin软件（Originlab Corporation，USA， https://www.originlab.com/ ）

程序

肌动蛋白纯化
第1天：
1. 准备1 L 1x G缓冲液（参见配方）。
2. 在50ml G-缓冲液中再水化并研磨2.5g冻干的兔骨骼肌丙酮粉末。
3. 通过在JA25.50转子（Beckman Coulter）中在4℃下以27,000 x g >离心1小时来清除溶液。
4. 将溶解的肌动蛋白收集在上清液中。
5. 通过加入50mM KCl和2mM MgCl 2，在250ml烧杯中聚合肌动蛋白1小时，然后在4℃下加入0.8M KCl 30分钟。
6. 通过使用Ti50.2转子（Beckman Coulter）在4℃下在150,000 离心3小时离心3小时来沉淀丝状肌动蛋白（F-肌动蛋白）。
7. 倒出上清液，用1ml G缓冲液轻轻洗涤沉淀表面两次。
8. 使用刮刀将颗粒转移到10ml匀浆器中（不要让颗粒干燥）并向均化器中加入1ml G-缓冲液。
9. 用G缓冲液洗涤离心管数次（使用总共7ml G缓冲液）。（此步骤可最大限度地恢复肌动蛋白）
10. 用均化器将颗粒均化。＆nbsp;
11. 使用超声波处理器在冰上使用1秒开启，在30秒振幅下以1秒关闭循环4秒钟对颗粒进行超声处理。
12. 取出均质溶液，使用SnakeSkin TM 透析管在4℃下用G缓冲液透析36小时。每12小时用新鲜的G缓冲液更换旧的G缓冲液（此步骤将允许F-肌动蛋白解聚）。
第2天：
1. 每12小时用新鲜缓冲液更换旧的G缓冲液。
第3天：
1. 使用Ti55转子在4℃下以200,000 x g >旋转2.5小时来清洁单体肌动蛋白，并收集上清液。
2. 用150ml 1x G-缓冲液平衡Sephacryl S-300HR柱。
3. 使用5ml样品环将从步骤A14收集的上清液加载到柱中。
4. 使用1x G缓冲液进行尺寸排阻色谱。
5. 凝胶过滤层析后收集单体肌动蛋白峰（洗脱体积约为50-60 ml）（图1）。＆nbsp;
6. 确定凝胶过滤中各个级分的浓度，并将G-肌动蛋白溶液储存在4°C（G-actin可以在4°C下储存而不会有明显的活性损失）。
  
  图1 G-肌动蛋白纯化的典型凝胶过滤曲线。肌动蛋白从Sephacryl S-300 HR柱纯化。 G-肌动蛋白以50-60ml洗脱。插图显示了G-actin洗脱峰分数的SDS-PAGE分析。
肌动蛋白聚合分析
1. 打开荧光分光光度计Cytation 5并启动软件。
2. 设置反应计划：
  参数：激发/发射：365 nm / 407 nm
  时间间隔：15秒
  周期数：299
  温度：室温
3. 准备1 ml 10x KME缓冲液和10 ml 1x G缓冲液（参见配方）。
4. 根据表1计算所需的聚合反应物质。对于一个反应，肌动蛋白混合物体积为25μl;最大额外蛋白质体积为10μl，10x KME缓冲液体积为12μl，加满1x G缓冲液至总体积为120μl。
5. 根据表1准备目标蛋白质原料。＆nbsp;
6. 根据表2制备肌动蛋白混合物并在冰上保持5分钟。
7. 根据表1，在Corning ® Costar ® 96孔细胞培养板中制备反应混合物（不含10x KME）。
8. 使用多通道移液管将12μl10xKME一起加入到每个孔中并轻轻混合反应溶液。
9. 将110μl反应溶液转移到96孔黑色板中，初始化荧光分光光度计进行数据采集。＆nbsp;
10. 使用Origin软件绘制数据（图1是肌动蛋白聚合测定的典型实例）。
  
  表1.肌动蛋白聚合计算实例表
  
  * G缓冲液用于将反应体积补足至120μl。
  **蛋白质和蛋白质缓冲液的最大总体积为10μl。
  
  表2.肌动蛋白混合计算示例表
  
  *使用用于实验的实际G-肌动蛋白和芘标记的肌动蛋白原种的值。
  **体积基于实际反应量。
  
  图2.芘肌动蛋白聚合测定实施例。将2微摩尔肌动蛋白与5％芘标记的肌动蛋白混合，用指定浓度的拟南芥formin AtFH1（FH1COOH）聚合。黑色，肌动蛋白;蓝色，200 nM AtFH1（FH1COOH）;紫色，500nM AtFH1（FH1COOH）。这三条曲线是肌动蛋白和formin典型行为的对照。

数据分析

所有体外>芘肌动蛋白测定均在Microsoft Excel或Origin软件中进行分析。将芘荧光强度（Y轴）绘制为时间（X轴）的函数。可以使用时间窗口绘制最终数据以用于不同目的。为了监测初始成核活动，通常＆lt; 1,000-1,500秒足以反映初始成核速率。对于一些蛋白质，肌动蛋白聚合的不同步骤的蛋白质活性可能不同，这取决于储存期间的蛋白质稳定性。适当的对照应包括在同一实验中（例如>，应始终包括肌动蛋白对照以了解肌动蛋白是否有效）。对于非稳定蛋白质，建议使用新鲜制备的蛋白质进行生物复制。

笔记

由于蛋白质活性和实际原因，芘肌动蛋白测定结果可以变化。需要重复实验。
时间对于实验很重要。为了获得更好的可重复结果，样品处理的时间控制是必要的。例如，一些肌动蛋白结合蛋白（如formin）会在几秒钟内迅速加速肌动蛋白聚合。＆nbsp;
尽量避免在移液过程中产生任何气泡。
使用切割技巧来吸取丝状肌动蛋白。
为每天的实验准备新鲜的G缓冲液和F缓冲液。
荧光分光光度计Cytation 5选择选项：
基于单色仪的检测模式（6-384孔板）：
1. 紫外 - 可见吸光度（230-999 nm，1 nm增量）
2. 荧光强度（250-700 nm（850 nm选项））
3. 时间分辨荧光（二级）
4. 发光＆NBSP;

食谱

100×G缓冲液，不含CaCl 2 （10 ml）
2毫升1M Tris-HCl，pH8
1毫升0.2 M ATP，pH 7
0.5毫升1M DTT，pH 7
将ddH 2 O加入10 ml
制备110μl等分试样并储存在-20°C
1x G缓冲液（10 ml）
100μl100xG缓冲液
9.9毫升冷ddH 2 O
10μl0.1MCaCl 2
准备新鲜的1x G缓冲液进行一天的实验并储存在冰上
10倍KME
500 mM KCl
10mM MgCl 2
10 mM EGTA
在室温下储存
F缓冲液（10毫升）
9毫升G缓冲液
1毫升10倍KME
准备新鲜的F-缓冲液进行为期一天的实验并储存在冰上

致谢

这项研究得到了NTU启动资助（M4081533），NIMBELS（NIM / 01/2016），MOE Tier 2（MOE2016-T2-1-005S）和MOE Tier 1（RG38 / 17-S）的支持。在新加坡。该协议改编自Sun 等人>（2018）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

Pollard，T。D.（2016）。肌动蛋白和肌动蛋白结合蛋白。 Cold Spring Harb Perspect Biol > 8（8）pii：a018226。
Pollard，T。D.和Cooper，J。A.（2009）。肌动蛋白，细胞形态和运动的核心参与者。科学> 326（5957）：1208-1212。
Sun，H.，Qiao，Z.，Chua，K.P.，Tursic，A.，Liu，X.，Gao，Y.G.，Mu，Y.，Hou，X。和Miao，Y。（2018）。 Profilin负调节formin介导的肌动蛋白装配，以调节PAMP引发的植物免疫。 Curr Biol > 28（12）：1882-1895 e1887。
Weinberg，J。和Drubin，D。G.（2012）。网格蛋白介导的芽殖酵母内吞作用。趋势细胞生物学 > 22（1）：1-13。