材料和试剂

纱布
面具
胶带纸
报纸
接种针
弹
培养皿，90 x 90 mm（Biosharp，目录号：BS-90-D）
乳胶手套（Biosharp，目录号：BS-ST-001）
Parafilm，100 mm x 38 m（Parafilm，目录号：PM-996）
无菌透气密封膜
盖玻片
解剖刀
新收获的玉米杂交种子（用于 Fusarium verticillioides >的生长，程序B）
土豆
Fusarium verticillioides >（真菌菌株与甘油在-80°C冰箱中保存）
Tween-80（Solarbio，目录号：P8360）
醇
无菌水
D-葡萄糖（Solarbio，目录号：G8150）
琼脂粉（Solarbio，目录号：A8190）
PDA介质（见食谱）

设备

玻璃棒
10μl移液器（Eppendorf，0.5-10μl）
酒精灯充满酒精
2,000毫升烧杯
500毫升锥形瓶
500毫升-1000毫升水瓶
塑料桶
超洁净工作台（HDL，型号：HD-1360）
轻型孵化器（海翔，型号：PGX-400BP）
高压灭菌器（Boxun，型号：YXQ-LS-52SII）
兽医可调连续注射器（嘉善，型号：2ml-K，目录号：JS-003，URL： http://www.jiashanqx.com/cn/products.asp?Bid=51 ）
光学显微镜（Motic，型号：BA310）
血细胞计数器（0.1 mm，1/400 mm 2 ，16 x 25）（秋菁，型号：XB-K-25）
冰箱（海尔，型号：BCD-215KS）

程序

真菌在PDA培养基上的繁殖（操作应在超洁净的工作台上进行）
1. PDA板的制备
  在121℃高温蒸汽灭菌半小时后，将熔化的PDA冷却至约60℃，然后倒入每个培养皿中约18-20ml直至完全凝固。
2. PDA媒体上的亚文化
  使用火焰对手术刀进行消毒，并在平板上挑选一些冷藏的 Fusarium verticillioides >。对其他一些印版重复此步骤。使用封口膜密封板，并在28°C的黑暗中保持5至7天。
3. PDA平板上的质量传播
  从上面步骤A2中培养的装有 Fusarium verticillioides >的PDA板的边缘用火焰消毒的手术刀切下1cm 2 的块，然后将其放在上面用于培养的新PDA板。重复此步骤，直到足够的板满足您的需求。然后在上述步骤A2中以相同条件培养这些板。
4. 在4°C冰箱中保存培养的 Fusarium verticillioides >
  当PDA板在5至7天后用 Fusarium verticillioides >填充时，将它们保持在4℃冰箱中使用。
Fusarium verticillioides >在玉米种子培养基上的繁殖（操作应在超洁净工作台上进行）
1. 煮玉米种子
  准备1,000克新收获的玉米杂交种子，没有杂质，霉菌和蛾的损害。用自来水洗涤种子2-3次，然后再用蒸馏水洗1次，除去剩余的自来水。向种子样品中加入3L蒸馏水，煮沸约2小时或更长时间，直到种子破裂并且含水量适中。适当的煮沸时间可以避免严重的颗粒破裂和高含水量，不利于 Fusarium verticillioides >的生长。
2. 将煮沸的种子分成锥形烧瓶
  从煮沸的玉米种子中除去剩余的水。然后将煮沸的种子装入500毫升锥形瓶中，加入200毫升生产线，并以此为标准。通常，1,000克种子可以制作10个锥形烧瓶，其中含有约200毫升煮沸的玉米种子。
3. 密封锥形烧瓶
  使用双层无菌透气密封膜或单层无菌透气密封膜加双层报纸密封带橡皮筋的锥形瓶。
4. 消毒
  使用高压蒸汽灭菌器在121°C下将带有种子的锥形瓶灭菌30分钟。然后，将它们在室温下保持48小时，以确保没有微生物污染（图1A）。
  
  图1. Fusarium verticillioides > 在玉米培养基上繁殖的操作程序。：一种。灭菌后的玉米种子。 B.用新培养的 Fusarium verticillioides >切割PDA培养基成小块。 C.将三片放入锥形瓶中。 D.充分混合后的玉米培养基。 E. Fusarium verticillioides >在玉米培养基上生长3天。 F. Fusarium verticillioides >在玉米培养基上生长8天。
5. 接种玉米种子
  在超洁净工作台中，将三片1cm 2 PDA培养基与新培养的 Fusarium verticillioides >一起放入锥形瓶中并充分摇动（图1B-1D）。当然，你也可以放三个以上的部分来加快传播速度。然后，在28℃的恒温培养箱中在黑暗中培养它们。一般来说，最佳收获时间是在第7天 -10 th 天，因为孢子数量很大，孢子活性很强（图1E和1F）。 > 注意：随着时间的推移，孢子数量不会增加，一些孢子会开始变形。所以最好在10天内收获它们。>
接种孢子悬浮液的制备
1. 收集孢子
  接种前一天，打开装有菌丝的锥形瓶，加入200ml无菌水后，在一个方向轻轻搅拌，然后通过八层纱布过滤到2,000ml烧杯中。通常，重复三到四次后，大部分孢子都会被洗掉。
2. 制备工作溶液
  稀释上面的孢子悬浮液并充分混合，然后在显微镜下使用血细胞计数器计数孢子数。确保孢子悬浮液的最终浓度为5×10 6 / ml。最后，每ml孢子悬浮液中加入2μlTween-80，混合均匀，保持在4°C使用。通常，每个锥形瓶中的孢子可以制成5L工作溶液。
  注意：一旦准备好工作溶液，请尽快使用，因为我们发现在4°C冰箱中两天后浓度会发生变化。在长时间使用之前，您需要重新计算工作溶液中孢子的数量。>
接种玉米
1. 合理的实验设计和优秀的现场管理在减少误差方面发挥着重要作用在接种试验田周围种植约4行边界玉米，以确保接种试验材料的生长是均匀的。设置2-3次重复以减少实验误差。控制害虫非常重要，例如玉米螟。
2. 接种时间
  根据我们的研究，最佳接种期是在授粉后约15天的乳汁阶段。此时，稻壳看起来仍然是绿色，丝绸刚刚变成棕色和干燥（图2A）。谷粒充满乳白色液体，看起来大而丰满，含水量约为60％（图2B）。因此，接种非常容易，适合 Fusarium verticillioides >的生长。无论是早期还是晚期接种都不利于接种和表型评估。如果早些时候，核心太少，无法进行接种，并且由于感染 Fusarium verticillioides >，整个耳朵将面临早期死亡。如果以后，内核变得难以穿透，并且由于内核中缺乏足够的水，真菌将不会发育良好。因此，耳朵的流行区域太小，无法揭示对玉米穗腐病的抗性差异。在实践中，非常重视不同玉米材料的生长阶段。
  
  图2.授粉后的自交系N6的17日龄耳朵。：一种。耳朵的外壳和丝绸。 B.内核的外观。
3. 接种方法
  我们通常在6：30-10：00和16：00-18：30进行接种，以避免高温影响接种效率。最佳剂量2毫升，需要两次注入耳中，1毫升，一次，以制作两个相距1厘米的接种孔。因为中间的籽粒经常丰满，两个接种孔可以提高接种成功率。将针头放入种子中比放在种子之间更好，因为它可以提高成功接种的速度。接种时，应将针头的延伸限制在耳朵的90度以下，以减少孢子悬液从接种孔中的流出（图3A）。最后，用一张纸胶带密封接种点（图3B）。
  注意：对于初学者，在接种实验之前练习几次是非常必要的，以减少操作引起的实验误差。>
  
  图3.现场接种方法。 A.注射器针头穿入内核但不进入穗轴。 B.用纸胶带密封接种点。
评分疾病
1. 表型评估在成熟阶段进行。一般来说，接种3天后，伤口周围的颜色会变成棕色，伤口周围会有稀疏的白色菌丝体。此时，伤口附近的核表面和核心行之间的空间也会有薄的白色菌丝体。受感染的谷粒在顶部开始变成黄褐色，这是丝绸和仁的交界处。随着时间的推移，受感染的区域将扩大，受感染的内核逐渐变为褐色直至腐烂。在接种后的第20天天，病害的谷粒出现在软化过程中，这是玉米穗腐病的典型症状。在接种20天后，菌丝开始缓慢扩散，因此感染区域几乎保持稳定直至成熟。
2. 我们发现至少有3种类型的症状由 Fusarium verticillioides >引起，如下文所述（Sun，2009），以及根据感染区域的种质资源的抗性评估（感染内核的百分比）耳朵）。
  1. 核仁发芽腐烂。例如，在较高湿度环境下的玉米品系177的种子将发芽，并且在发芽种子周围存在严重条件下的白色菌丝体（图4A）。
  2. 核在有限区域内腐烂，例如Yu 374（图4B）。
  3. 核心在大面积内腐烂，如近交系N6（图4C）。
    
    图4.不同玉米自交系的不同穗腐病症状。 A.玉米品系177. B. Yu 374. C.近交系N6。
3. 玉米穗腐烂根据感染面积（整个穗中受感染的籽粒的百分比）分为七个等级（表1）。通常，为了最大限度地减少错误，两位经验丰富的研究人员足以进行表型评估。
  
  表1.玉米穗腐病的评级等级
4. 在短时间内完成玉米穗腐病的大规模评估是非常困难的。所以，你可以用稻壳收获它们。用稻壳在阳光下干燥耳朵2-3天;然后可以进行表型评估。如果没有外壳，由于耳朵干燥，很容易导致内核损失。但是，最好尽快评估表型，以尽量减少实验误差。
5. 此外，你可以组织劳动力去除田间的稻壳，打破耳朵的上部茎，只留下耳朵进行评估。根据绘图区域的评估，选择一些评估者进行评估。经验丰富的评估员可在8小时内评估约0.1公顷的接种田地。请注意，评估者的选择应与评估标准一致，并且相同材料的等级应尽可能一致。
6. 通常，我们同时记录整个耳朵中受感染内核的百分比和等级。

数据分析

分析方法取决于实验设计。
为了更好地评估疾病等级，应根据1-3个等级同时评估材料的结实率。在您稍后的统计计算中，您可以有效地消除由于缺乏完整结果而导致的异常值。结实率1级表明全粒占穗区面积的75％以上，2级表示全粒占穗区面积的50％-75％。 3级意味着全谷物占穗区面积的不到50％。

笔记

在遗传研究和育种中，为了减少果实引起的玉米穗腐病评价误差，可以通过人工辅助授粉，收集其他玉米植株的花粉，提高结实率。我们的研究表明，个别材料可能具有人工补充授粉引起的森果效应，但其他材料的花粉对当代玉米穗腐病的抗性没有影响。

食谱

PDA媒体
200克/升马铃薯（煮沸并过滤入烧杯）
20克/升D-葡萄糖
15克-20克/升琼脂粉
在121°C高压灭菌30分钟

致谢

该项目由国家自然科学基金（NSFC）（批准号：31761143009）和河南省高校重点科研项目（批准号：18A180014）资助。我们感谢团队中的研究生们为玉米穗腐烂相关研究所做的努力。

利益争夺

作者指出，没有利益冲突或竞争利益。

参考

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