材料和试剂

100-1,000μl移液器吸头（KASVI，目录号：K8-1000B）
Eppendorf Safe-Lock管，1.5 ml（Eppendorf，目录号：0030120086）
琥珀，写字，认证，2毫升，螺旋盖小瓶包装（安捷伦科技，目录号：5182-0554）
C57BL / 6小鼠的血清，结肠腔内容物和粪便
盐酸，37％（v / v）（Sigma-Aldrich，目录号：320331）
无水柠檬酸（CinéticaProdutosQuímicos，目录号：278）
氯化钠（CinéticaProdutosQuímicos，目录号：415）
四氢呋喃（Merck，目录号：1081012500）
乙腈（Sigma-Aldrich，目录号：60004）
正丁醇（Sigma-Aldrich，目录号：34867）
乙酸，分析标准品，GC测定≥9.8％（Sigma-Aldrich，目录号：71251）
丙酸，分析标准品，GC测定≥9.8％（Sigma-Aldrich，目录号：94425）
丁酸，分析标准品，GC测定≥9.8％（Sigma-Aldrich，目录号：19215）
盐酸
蒸馏水
1-甲基萘
Ñ<子> 2
ħ<子> 2
0.1 M HCl溶液（见食谱）
血清原液中含有3,000μg/ ml乙酸（参见食谱）
3,000μg/ ml丙酸储备液（参见食谱）
3,000μg/ ml丁酸储备液（参见食谱）
1,000μg/ ml SCFA标准混合物（见食谱）

设备

J＆amp; W DB-23 GC色谱柱，60 m，0.32 mm，0.25μm，7英寸笼（Agilent Technologies，目录号：123-2362）
钳子
冷冻柜FE26 / 127V（Electrolux Appliances，型号：FE26，目录号：04251FBA106 / 04251FBB206）
不锈钢双刮刀，长180 mm，直径3 mm（MetalicAcessóriosparaLabalratório，目录号：063-A3）
PIPETMAN Classic P1000移液器（Gilson，产品目录号：20170-170）
气相色谱仪Agilent 6850系列（安捷伦科技，制造商停产）
DB 23安捷伦毛细管柱，内径60 m x 0.25 mm（ i.d。）
烤箱
自动液体采样器7683B（Agilent Technologies，目录号：G2880A）
分析天平（SHIMADZU，型号：ATX224系列，未找到产品目录号）
涡旋混合器（Phenix Luferco，型号：AP56）
离心机5810 R（Eppendorf，型号：5810 R，目录号：5810000424）
气相色谱仪Shimadzu 2010型号，配备FID（SHIMADZU，目录号：C184-E019）
AOC-20i自动液体采样器（SHIMADZU，型号：AOC-20i）

软件

EZChrom软件，3.3.1版本（安捷伦科技）
GC解决方案软件，3.2版（SHIMADZU）

程序

样品制备
1. 收集心脏穿刺或腋窝丛的血液。在室温（RT）下保持血液30分钟并离心（3,000 x g ，8分钟）。收集血清并在-80℃下在1.5ml微管中冷冻。
2. 在微管中直接从每只小鼠收集粪便颗粒。为此，抬起抱着尾巴的动物，将微管置于肛门附近并收集排出的颗粒。每只动物的两个或三个颗粒就足够了。
3. 安乐死后，收集结肠，轻轻取出近端部分的腔内容物。为此，使用镊子直接收集到微管中并在-80°C下冷冻。
4. 将所有生物样品保持在-80°C冷冻直至分析当天。
5. 对于粪便和结肠腔内容物，将20mg这些转移到1.5ml微管中并加入200μl蒸馏水。使用金属刮刀均质化。＆nbsp;
6. 在1.5 ml微量管中，加入样品（200μl血清或粪便匀浆，参见步骤A5），200μl有机溶剂混合物，由正丁醇，四氢呋喃和乙腈组成，比例为50:30:20，40 μlHCl0.1M，20mg柠檬酸和40mg氯化钠。使用涡旋搅拌器剧烈摇动微管1分钟。
7. 在室温下将样品在14,870 x g 离心10分钟。
8. 使用自动移液器，将上清液转移到配有200μl插入物的色谱小瓶中，并通过GC-FID进行分析（图1）。
  
  图1.样品制备。 A.样品的液 - 液萃取程序。用相同体积的溶剂混合物提取血清样品（200μl）。 B.粪便和结肠腔内容物样品的液 - 液萃取程序。将粪便样品（20mg）预先用蒸馏水均化，并进行样品制备部分的步骤A5-A8中所述的提取步骤。＆nbsp;
GC程序
1. 将进样器的温度调节至250°C。
2. 使用DB 23毛细管柱Agilent 60 mx 0.25 mm内径（ id ），以25：1的分流比注入内容物（5μl），并涂上0.15μm的薄膜组成80.2％的1-甲基萘。
3. 流动相由N 2组成，初始流速为1 ml / min，保持1 min，然后变为0.8 ml / min，持续1 min，更换为0.6 ml / min 1分钟，然后恢复到1毫升/分钟，持续9.2分钟。
4. 调整并保持FID检测器的温度在260°C。
5. 将H 2和合成空气的流量分别调节至30 ml / min和350 ml / min。
6. 将烤箱的温度程序调整为100°C，保持7分钟，以25°C / min的速度升至200°C并保持5分钟。

数据分析

通过分析血清（图1A）和粪便（图1B）产生的色谱图如图2所示。与分析标准溶液相比，SCFA通过保留时间进行鉴定。

图2.血清（A）和粪便（B）样品的色谱图。每种SCFA的保留时间如下：乙酸盐，5.2分钟;丙酸，7.1分钟;丁酸盐，9.08分钟。使用配备有7683B自动液体取样器和FID的气相色谱仪Shimadzu 2010型进行分析。
使用EZChrom软件集成每个峰的区域，对应于其各自的SCFA。
使用本研究中的基质（血清和粪便）作为溶剂稀释分析物，制备标准校准曲线，一式三份，SCFAs浓度范围为15-1,000μg/ ml。构建血清基质中的校准曲线，使用血清作为溶剂制备1,000μg/ ml的SCFA储备溶液，并在15-1,000μg/ ml的范围内连续稀释（参见配方）。
在粪便基质中构建校准曲线，根据血清中SCFA储备液的获得方法，使用蒸馏水作为溶剂制备1000μl/ ml SCFA（参见配方）。
根据程序A，步骤5-8中描述的液 - 液萃取程序准备样品，并按照程序B，GC程序中所述通过GC-FID分析样品。
标准校准曲线显示所有酸的线性回归关系（R 2 = 0.998）（图3）。

图3.（A）血清和（B）粪便的标准校准曲线的线性。使用血清（A）和粪便（B）获得的校准曲线。使用气相色谱仪Agilent 6850系列获得线性，配备7683B自动液体进样器和FID，遵循本文所述的参数。
乙酸，丙酸和丁酸的保留时间分别为7.2,8.2和9.2分钟，每次分析的总运行时间为16.5分钟。
精度，表示为相对标准偏差（RSD）小于15.0％，精度，表示为相对误差（RE）在±15.0％之内。提取效率（EE）大于97.0％。要计算RSD，RE和EE，请使用下面描述的公式：
对于标准曲线，在y轴上绘制每个SCFA标准样品的面积与相应的理论浓度值（15-1,000μg/ ml），并获得函数y = ax + b的等式，其中 a 是角系数， x 是为样本找到的区域， b 是线性系数。
使用下面显示的等式计算样品中每种SCFA的浓度。每种SCFA的浓度表示为mg / ml。
使用下述公式分别转换血清和粪/肠腔内容物样品的浓度为mM和mmol / kg：

笔记

我们的实验室不提供安捷伦设备。因此，我们使用GC Shimadzu 2010模型获得色谱图以说明分析物分离（图2和4）。色谱图按照本文所述的生物分析方法条件获得。

图4.从抗生素处理的小鼠和对照动物（未用抗生素处理）获得的结肠腔内容物的色谱图重叠。色谱图显示用抗生素（蓝线）和未处理动物（黑线）处理的动物（Fellows et al。，2018）。根据本文所述的参数，使用配备有AOC-20i自动液体取样器和FID的气相色谱仪Shimadzu 2010型进行分析。使用GC解决方案软件整合色谱图。
分析物的保留时间和检测范围可能根据毛细管柱类型和长度以及设备品牌而有所不同。 DB-23毛细管柱安捷伦可用于GC Shimadzu 2010型号。
该方法是根据ANVISA（National Sanitary Vigilance Agency）的RDC 27/2012开发和验证的。
如果使用不同的小鼠品系，则不需要改变方案。
动物被安置在圣保罗大学生物医学科学研究所和坎皮纳斯大学生物学研究所。
空白血清是未添加SCFAs标准的血清。

食谱

0.1 M HCl溶液
0.835毫升HCl 37％（v / v）
加入99.165毫升蒸馏水
血清原液中含有3,000μg/ ml乙酸
5.7μl分析标准乙酸，GC测定≥99.8％
加入2,000μl空白血清
涡旋1分钟
3,000μg/ ml丙酸储备液
6.06μl分析标准丙酸，GC测定≥99.8％
加入2,000μl空白血清
涡旋1分钟
3,000μg/ ml丁酸储备液
6.2μl分析标准丁酸，GC分析99.8％
加入2,000μl空白血清
涡旋1分钟
1,000μg/ ml SCFA标准混合物
将每种SCFA储备溶液混合1ml，得到每种SCFA1000μg/ ml（最终体积3ml）
标准SCFA解决方案
1. 使用血清作为溶剂对该混合有机酸溶液进行连续稀释，以产生15-1,000μg/ ml的范围作为血清基质中SCFAs的标准曲线。
2. 使用蒸馏水作为基质进行相同的系列稀释，以构建粪便基质中SCFAs的标准曲线。为了实现这一点，准备7个含有20毫克粪便的试管，并在每个试管中加入200μl分别在连续稀释液中获得的溶液

致谢

我们感谢Claudete Justina Valduga和PatríciaSartorelli为本研究提供设备。这项工作得到了FAPESP 2012 / 50410-8和CNPq（国家科学和技术发展委员会）的支持，项目编号为486037 / 2012-6至C.M.F，2017 / 10653-9为M.A.V.

利益争夺

作者宣称不存在利益冲突。

伦理

所有实验程序均由坎皮纳斯大学生物学研究所动物使用伦理委员会（方案号3742-1）和圣保罗大学动物护理委员会（方案号181/114/02）批准。此外，它是根据巴西控制和实验委员会的指导方针进行的。

参考

Andrade-Oliveira，V.，Amano，MT，Correa-Costa，M.，Castoldi，A.，Felizardo，RJ，de Almeida，DC，Bassi，EJ，Moraes-Vieira，PM，Hiyane，MI，Rodas，AC， Peron，JP，Aguiar，CF，Reis，MA，Ribeiro，WR，Valduga，CJ，Curi，R.，Vinolo，MA，Ferreira，CM andCamara，NO（2015）。肠道细菌产品可预防缺血再灌注引起的AKI。 J Am Soc Nephrol 26（8）：1877-1888。
Correa-Fiz，F.，Fraile，L。和Aragon，V。（2016）。断奶时的仔猪鼻腔微生物群可能会影响饲养期间Glasser病的发展。 BMC Genomics 17：404。
Cuervo，A.，Salazar，N.，Ruas-Madiedo，P.，Gueimonde，M。和Gonzalez，S。（2013）。常规饮食中的纤维与老年人的粪便短链脂肪酸浓度直接相关。< / a> Nutr Res 33（10）：811-816。
den Besten，G.，van Eunen，K.，Groen，A.K.，Venema，K.，Reijngoud，D。J. and Bakker，B.M。（2013）。短链脂肪酸在饮食，肠道微生物群和宿主能量代谢之间的相互作用中的作用。 J Lipid Res 54（9）：2325-2340。
研究员，R.，Denizot，J.，Stellato，C.，Cuomo，A.，Jain，P.，Stoyanova，E.，Balazsi，S.，Hajnady，Z。，Liebert，A.，Kazakevych，J.， Blackburn，H.，Correa，RO，Fachi，JL，Sato，FT，Ribeiro，WR，Ferreira，CM，Peree，H.，Spagnuolo，M.，Mattiuz，R.，Matolcsi，C.，Guedes，J.， Clark，J.，Veldhoen，M.，Bonaldi，T.，Vinolo，MAR和Varga-Weisz，P。（2018）。微生物衍生的短链脂肪酸通过组蛋白去乙酰化酶促进结肠中的组蛋白巴豆酰化。 Nat Commun 9（1）：105。
Ferreira，C.M.，Vieira，A.T.，Vinolo，M.A.，Oliveira，F.A.，Curi，R。和Martins Fdos，S。（2014）。肠道微生物群在慢性炎症性疾病中的核心作用。 J Immunol Res 2014：689492。
Karlsson，C.，Ahrne，S.，Molin，G.，Berggren，A.，Palmquist，I.，Fredrikson，G。N.和Jeppsson，B。（2010）。对患有早期动脉硬化的男性进行益生菌治疗可以促进结肠细菌多样性增加：一项随机对照试验。动脉粥样硬化 208（1）：228-233。
Koh，A.，De Vadder，F.，Kovatcheva-Datchary，P。和Backhed，F。（2016）。从膳食纤维到宿主生理学：短链脂肪酸作为关键的细菌代谢物。 Cell 165（6）：1332-1345。
Mendes，E.，Acetturi，BG，Thomas，AM，Martins，FDS，Crisma，AR，Murata，G.，Braga，TT，Camara，NOS，Franco，A.，Setubal，JC，Ribeiro，WR，Valduga，CJ ，Curi，R.，Dias-Neto，E.，Tavares-de-Lima，W。和Ferreira，CM（2017）。预防性补充长双歧杆菌5 1A保护小鼠免受卵巢切除术引起的加剧过敏性气道炎症和气道高反应性。 Front Microbiol 8：1732。
Nishida，A.，Inoue，R.，Inatomi，O.，Bamba，S.，Naito，Y。和Andoh，A。（2018）。肠炎微生物群在炎症性肠病的发病机制中的应用。 Clin J Gastroenterol 11（1）：1-10。
Salazar，N.，Dewulf，EM，Neyrinck，AM，Bindels，LB，Cani，PD，Mahillon，J.，de Vos，WM，Thissen，JP，Gueimonde，M.，de Los Reyes-Gavilan，CG and Delzenne， NM（2015年）。菊粉型果聚糖调节肠道双歧杆菌种群，减少肥胖妇女的粪便短链脂肪酸。 Clin Nutr 34（3）：501-507。
Sokolowska，M.，Frei，R.，Lunjani，N.，Akdis，C.A。和O'Mahony，L。（2018）。微生物组和哮喘。哮喘治疗 4：1 。
Vieira，A。T.，Castelo，P。M.，Ribeiro，D。A.和Ferreira，C。M.（2017）。口腔和肠道微生物群对更年期妇女健康的影响。前微生物 8：1884。
Vinolo，MA，Rodrigues，HG，Festuccia，WT，Crisma，AR，Alves，VS，Martins，AR，Amaral，CL，Fiamoncini，J.，Hirabara，SM，Sato，FT，Fock，RA，Malheiros，G.， dos Santos，MF和Curi，R。（2012）。 Tributyrin可减轻高脂喂养小鼠的肥胖相关炎症和胰岛素抵抗。 Am J Physiol Endocrinol Metab 303（2）：E272-282。
Walton，G.E.，Lu，C.，Trogh，I.，Arnaut，F。和Gibson，G.R。（2012）。一项随机，双盲，安慰剂对照的交叉研究，以确定消耗的胃肠道影响阿拉伯木聚糖 - 寡糖在健康志愿者中富含面包。 Nutr J 11:36。
Zhang，H.，Sun，J.，Liu，X.，Hong，C.，Zhu，Y.，Liu，A.，Li，S.，Guo，H。和Ren，F。（2013）。副干酪乳杆菌亚种。 paracasei LC01可以正常调节健康年轻人的肠道菌群。 J Microbiol 51（6）：777-782。