材料和试剂

注意：所有材料和试剂均可根据实验室资源进行调整。例如，不需要特定的钳子和玻璃设备，但是可以执行一些特定的预防措施。有关选项，请参阅表1.

滤纸（例如，玻璃微纤维滤光片，GF / D，47 mm，孔径0.47微米，Whatman，目录号：1823-047）
铝箔盖切成所需尺寸或非塑料盖
实验室手套（例如，蓝色丁腈手套，VWR，目录号：112-2373）
网眼（例如，200μm单丝尼龙纤维网）＆nbsp;
过滤水（例如，Milli-Q过滤水，0.22μm膜过滤器）
乙醇绝对值> 99％（v / v）（VWR，目录号：20821.310E）＆nbsp;
氢氧化钾，KOH，85.0％-100.5％，颗粒（VWR，目录号：26668.296）
氯化钠，NaCl，99.5％-100.5％，颗粒（VWR，目录号：27810.364）
<碘化钠，NaI>， 99.5％（VWR，目录编号：27913.260）
聚钨酸钠溶液，SPT 85％（v / v）（Sigma-Aldrich，目录号：80656）

设备

500毫升烧杯（Corning，Pyrex®，目录号：1395-500）
磁力搅拌器（Sigma-Aldrich，Benchmark，目录号：Z742550）
用于47 mm过滤器的真空过滤瓶组件，带有漏斗，过滤器夹（例如，2,000 ml，VWR，目录号：511-0264H和Fisher Scientific，Kimble TM，目录号：K953771-0000）＆nbsp;
真空泵（例如，迷你隔膜真空泵，VP86，VWR，目录号：181-0065H）
不锈钢筛：1 mm，0.5 mm，0.25 mm和较小的筛子，当需要较小的尺寸限制时
棉和白色实验室服装
非塑料解剖工具（包括剪刀，镊子和手术刀）
带摄像头的立体显微镜（例如，徕卡显微系统，型号：MZ6）
FT-IR仪器（或可能用于化学分析的类似设备）＆nbsp;
冰箱
孵化器和振动器（例如，New Brunswick Scientific，型号：Innova 26R）

程序

样品采集
在这里，我们描述了从现场采集样品的逐步程序（步骤A1-A4，图1）。我们知道用于收集的方法可能会根据目标样本而改变。包括污染控制步骤的重要性，因为收集样品时需要此信息。

图1.从脊椎动物消化道，粪便和反流中提取塑料和微塑料的程序步骤
1. 按照动物尸检的标准方案收集消化道（例如，Kuiken和Garcia-Hartmann，1991）。消化道必须用缰绳或绳索固定，以避免内容物损失。如果消化道不立即处理，应将它们储存在耐用的容器中。当使用塑料袋时，建议使用明亮的颜色。因此，在意外污染的情况下，这种塑料件将易于识别。
2. 在可能的情况下，粪便和回流物收集在透明塑料拉链袋或透明玻璃容器中。
3. 建议在收集所有样品时使用白手套和白色棉质实验室外套/衣服。必须注意使用的任何其他颜色和聚合物材料以供参考，以便在进行分析时考虑潜在的污染。
4. 样品应该是新鲜加工的，但是如果不能这样做，样品可以在-20°C或更低温度下冷冻直至需要。
试剂准备
注意：KOH是一种腐蚀性和刺激性的溶剂。所有研究人员必须始终佩戴实验室手套和眼睛保护装置。如果溶液接触皮肤，应立即用流水冲洗受影响的区域。
1. 要制备10％KOH溶液，将100克KOH加入1,000毫升水中。可根据样品处理要求调整溶液体积。建议在带盖的烧杯或锥形瓶中制备溶液。
2. 关闭盖子并轻轻混合直至颗粒溶解，这可以通过手动摇动或使用磁力搅拌器进行，这取决于所制备的体积。一旦颗粒溶解，溶液就会变成无色，静置至少15分钟。
3. 应使用布氏过滤器或类似方法（表1）过滤最终溶液，以确保溶液中没有残留的微塑料，无论是来自KOH颗粒，水还是来自程序污染。
实验室准备
1. 实验室应在使用前进行清洗，以清除任何空气污染源。应尽可能减少外部污染。
2. 实验室的研究人员应穿白色棉质实验室外套和手套。必须注意使用的任何其他颜色和聚合物材料以供参考，以便在进行分析时考虑潜在的污染。
3. 所有设备必须在使用前立即用预过滤水冲洗至少三次。建议使用玻璃或金属设备，但如果不可避免，请参见表1.用于冲洗样品的供水必须使用筛孔尺寸小于目标微塑料的筛网过滤。应注意设备颜色的任何变化。
4. 在与预过滤水源连接的水槽中设置嵌套金属筛。顶部的筛网具有最大的筛孔尺寸（例如，1mm），而底部的筛网具有较小的筛网尺寸（例如，50μm）。使用连续的筛子可以去除更大的塑料，食物残渣和寄生虫。如果研究人员希望针对较小的塑料，他们可以添加额外的筛子。这允许尺寸区分并加速后续步骤中的处理。不使用时，应用盖子盖上筛子以防止污染。
  
  表1.故障排除建议和替代方法
样品制备
1. 如果样品已冷冻，建议将样品在冰箱中缓慢解冻（24-36小时），以避免组织快速分解。也可以在干净的实验室中在室温下对样品进行解冻。
  注意：根据收集的样本，需要不同的初始处理步骤。对于消化道样本，继续执行步骤D2-D10，进行反流和散布样本从步骤D11-13开始。
消化道
1. 消化道必须在处理之前进行外部清洗，并去除带子以去除外部污染。
  注意：Ties用于阻止内容泄漏。
2. 海洋生物的消化道长度和隔室（食道，胃和肠）的数量不同。每个隔室应独立处理和冲洗（例如，Hernandez-Milian 等。，2018）。
3. 如果鱼消化道的不同部分无法区分，则可以不分割地进行分析。
4. 对于大肠（> 1米，即，哺乳动物），我们建议分成较小的，同等大小的碎片。最合适的数字是20个相等的部分。这部分消化道的划分将允许研究人员研究微塑料是否倾向于像某些寄生虫一样集中在任何特定区域（Lawlor et al。，1990），并使其可行分析大样本。
5. 必须使用干净且经过消毒的剪刀和镊子打开每个隔室或肠道部分。
6. 应从大量猎物残骸的中间收集用于遗传分析的子样本并冷冻储存或在70％预过滤的乙醇中储存。
7. 将剩余材料转移到嵌套筛柱中，避免接触粘膜表面。
8. 应小心检查胃和肠粘膜表面，以防止用手指或其他材料摩擦表面。如果检测到任何病理，应收集该区域的样本，并按照标准方案使用所需的固定化学品进行储存。
9. 在步骤E1之后，应通过嵌套筛网在过滤水供应下单独处理隔室。
粪便和反流（固体样本）
1. 储存粪便和反流的容器必须在加工前用预过滤的水冲洗外部。这将避免程序污染。
2. 将收集来自样品中间的子样品并冷冻或储存在70％乙醇中用于遗传分析。
3. 在步骤E1之后，应将其余样品倒入并在嵌套筛中处理。如果粪便或回流的样品不是流体，则可以在加工前将它们倒入具有预过滤水的容器中几个小时以进行水合。样品必须始终盖上盖子以防止程序污染。
样品处理
1. 将每个样品或隔室分别冲洗到嵌套筛中（图1）。
2. 将收集在两个顶筛中的非塑料材料转移到含70％乙醇的容器中2至24小时，以对材料进行消毒并防止霉菌和气味。
3. 储存硬质食物残留物（例如，耳石，骨骼，贝壳）干燥在袋子或容器中，而头足类动物喙和其他软遗骸（例如，甲壳类动物，蠕虫，寄生虫）应储存在70％乙醇中进行进一步鉴定（图1）。
4. 用预过滤的水冲洗较大筛子中的塑料材料（> 1mm）并储存干燥。将保存在较小筛网中的材料转移到具有预过滤水的玻璃容器中，以获得微塑料样品的悬浮液（图1）。
5. 悬浮液应尽可能浓缩。这将减少后续步骤中所需的KOH溶液的体积。
注意：此步骤必须佩戴眼睛。
1. 以3：1（KOH：悬浮液）的比例向悬浮液中加入10％KOH溶液（图1）。
2. 用铝箔或螺旋盖盖松散地覆盖样品，以防止污染和蒸发。
3. 将样品在60℃下孵育24小时，同时以125rpm连续搅拌;或者，可以放弃加热，但反应需要更长的时间（例如，3周，Foekema 等，2013）。
4. 当所有生物材料都被消化后，溶液将变成透明/淡黄色。
5. 从培养箱中取出样品并在进一步处理前冷却。
6. 冷却后，使用诸如玻璃布氏过滤器和微纤维过滤器（GF / D或替代）的设备在真空下过滤溶液。或者，如果此设备不可用，可以使用在过滤期间覆盖微纤维过滤器的玻璃漏斗。
  注意：使用前必须在显微镜下检查滤纸是否有污染。
7. 当过滤后仍留有大量未消化的有机物质（例如，骨头）时，密度浮选可用于将未溶解的有机物质与将漂浮的低密度塑料分离。使用密度分离时需要非常小心，因为有一些不太密集的饮食残骸可以漂浮，例如甲壳类甲壳。 NaCl是推荐的密度分离溶液（1.2 g cm -3）。更昂贵的溶液包括NaI（1.8g cm -3）和SPT（2.8g cm -3）。
8. 除去未消化的有机物质的另一种选择包括在过滤之前再次通过筛子冲洗溶液;这减少了滤纸堵塞的可能性。
视觉表征
当研究人员对样品进行分类和分类时，视觉表征很有价值。塑料的视觉表征必须与其他更强大的识别技术一起使用，例如化学分析（例如，步骤F4-F5，G1-G7），即使可以识别大型塑料。如果没有更强大的技术，步骤F4-F5可以帮助研究人员减少错误识别的可能性。
1. 使用立体显微镜研究保留在滤纸上的颗粒。建议将相机连接到显微镜上，以便研究人员记录所有颗粒的视觉图像。
2. 目视检查每个滤纸上是否有潜在的塑料微粒。
3. 按照现有标准进行视觉表征（Lusher et al。，2014）：
  1. 测量的最长尺寸（mm）和最小孔径长度。
  2. 记录形状和颜色（图1）。
    1. 形状类别包括：纤维，碎片和球形（珠子）。根据研究目标，碎片可以进一步分为薄膜和泡沫，但这种划分并不总是必要的。
    2. 颜色是主观的，因此不建议作为独立分类，但它在分类样本时确实有助于研究人员。
4. 观察到的颗粒需要在视觉上检查以下特征，否则应该拒绝或使用其他化学技术进行测试（Lusher et al。，2014）：
  1. 均匀的颜色。
  2. 没有天然结构（如细胞）。
  3. 不自然的弯曲。
  4. 纤维在整个长度上应具有一致的厚度。
  5. 纤维末端不应有磨损。
5. 在视觉表征期间可以使用热针以帮助存在塑料颗粒，在塑料的情况下，塑料颗粒将通过弯曲或熔化对热量起反应。该方法已被国家海洋和大气管理局（NOAA）和欧盟根据海洋战略框架指令（EU-MSFD）推荐，但热针不适用于半合成纤维，因为它们不反应。因此，建议一些研究小组谨慎采取这一步骤。
化学特性
注意：化学表征只能在清洁干燥的可疑塑料颗粒上进行。
1. 化学表征应在代表性的子样品上进行。 MSFD推荐10％，尽管应尽可能多的颗粒进行化学分析，以减少识别错误。
2. 用于化学分类的具体仪器将取决于可用的研究设施。在这里我们描述了FT-IR，因为这种仪器可以在大多数研究实验室获得（图1）。
3. 训练有素的人员应进行化学分析。需要足够的聚合物识别和光谱解释知识。
4. 光谱分析应遵循各个实验室可用的协议来产生输出光谱。
5. 应将所有输出光谱与聚合物库数据库进行比较。
6. 只有与高参考光谱匹配且具有高确定性（> 70％匹配）的聚合物才应被接受作为正确的鉴定。
7. 具有足够聚合物知识的研究人员也可以考虑对产生的光谱进行目视检查，这些光谱具有较低的确定性（60％-70％）。应谨慎对待这种解释。一个例子是吸水率，它可以改变光谱并具有明显的聚合物特性。

数据分析

该协议是用于收集微塑料的标准协议。数据分析取决于协议的特定用户要求。建议研究人员评估每个确定的隔室（胃，肠切片或个体粪便和/或反流）中的颗粒数量。获得的值可以与来自相同研究区域或更远地区的其他样品进行比较。特别划分消化道和肠道使研究人员能够比较物种之间和物种内的微弹性水平（Lusher et al。，2018）。

致谢

作者没有为制定该协议获得外部资金，A.L.L。和G.H.M.承认他们以前的资助者支持他们早先的调查。所有。由爱尔兰研究理事会研究生奖学金和2012-2015学年GMIT 40周年学生资助。 G.H.M.作为爱尔兰政府2013 - 2015年国家发展计划（NDP）的一部分，该项目得到了博福特生态系统渔业管理奖的支持。两位作者都感谢国家公园和野生动植物管理局（NPWS）向爱尔兰鲸鱼和海豚集团（IWDG）报告了这些情况。
作者贡献： A.L.L。和G.H.M.构思并设计了协议;进行实验，分析数据;并平等地写了这篇论文。
该协议是作者对以往工作的适应性的最终结果。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

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