材料和试剂

无毒永久性标记，原色＆nbsp;
舀
膨胀聚苯乙烯泡沫塑料（从Home Depot购买，Cellofoam®，目录号：150705）＆nbsp;
50毫升Falcon管（Thermo Fisher Scientific，Falcon® 50 ml锥形离心管，目录号：14-432-22）＆nbsp;
纸巾（Kimberly-Clark Professional *，Scott® C-Fold Towel，目录号：06041）
1 ml注射器或巴斯德吸管（Thermo Fisher Scientific，BD Lo-Dose TM U-100 Insulin Syringes，目录号：14-826-79）＆nbsp;
Long Evans大鼠（原始种鸡从Charles River实验室购买并在AAALAC认可的动物设施中繁殖，17至25日龄）
在LDPE喷雾或喷射瓶中的500ml 70％乙醇溶液（购自Thermo Fisher Scientific的4升乙醇[无水]，目录号：A405P-4）
基于大豆的婴儿配方奶粉（22盎司购自Walmart，Enfamil TM ProSobee Soy Infant Formula，目录号：2667028）＆nbsp;
蒸馏水（150毫升与乙醇混合，约40毫升与大豆配方混合）
检查手套（Thermo Fisher Scientific，Fisherbrand TM无粉丁腈检查手套，目录号：19-130-1597C）

设备

灯光明亮的测试室（3.6 x 5.25米，带有生物安全罩，顶置荧光灯和两个可在最高设置下调节亮度的落地灯）（图1A）
巴恩斯迷宫仪器（图1B）
1. 圆形平台（木材涂有透明树脂，直径1.2米），沿着距平台边缘5厘米的周边有8个等间距的孔（直径10厘米）（在Home Depot购买的树脂，Rust-Oleum Parks®，Gloss Super Glaze内部装饰和防腐剂，型号：241352）
2. PVC平台支架离地面高0.75米，带木底座（图1C）
3. PVC逃生箱，9.19 x 3.00英寸（Madesmart®，目录号：59973）（图1D）
4. 旋转杆连接在平台下以固定逃生箱并允许每窝更换目标位置（图1E）
5. 迷宫下方的地板上有泡沫或泡沫包裹，以缓冲潜在的跌落（图1F）
图1.适用于幼年动物的Barnes迷宫的实验装置。 A.行为测试室和分析室的安排。 B-F。适用于巴恩斯迷宫平台（B）的图像，带有木质底座的PVC平台支架（C），PVC逃生箱（D），用于逃生箱的旋转杆（E），用于潜在坠落的泡沫垫（F）。
白色窗帘具有独特的图案，由大型几何形状组成，在迷宫周围创造四个视觉线索墙，并在测试过程中保持实验者隐藏（图2）

图2.适用于幼年动物的Barnes迷宫的视觉提示。：一种。白色窗帘增加视觉线索。 B.从右到左的视觉提示的尺寸：水平矩形（163×25cm），三角形（底部= 55cm，高度= 64cm），圆形（直径= 25cm），垂直矩形（25×147cm），条纹（8 x 163厘米）。
顶置摄像头（1/3“CCD，30帧/秒，Panasonic，型号：WV-CP280-N）
PC电脑＆nbsp;
秒表

软件

视频软件（ULead Video Studio，Corel）
TopScan版本2.00，CleverSys
Microsoft Excel

程序

有关整个过程的概述，请参见图3A。

在测试之前
从A-H顺时针分配8个逃生孔中的每一个。将逃生箱分配给其中一个迷宫孔，并将逃生箱连接到位于该孔下方的旋转臂。在剩余的训练（第2-3天）中保持这个位置一致。通过将迷宫分成四个象限，分配四个下落位置（起始位置1-4）（图3B）。
在昏暗的灯光下探索（第1天）
1. 在迷宫暴露之前将家笼置于测试室中的生物安全罩中15分钟以适应习惯。使用尖锐物，在尾巴上标记每种动物不同的颜色。＆nbsp;
2. 将房间灯设置为最低强度（~25 lux）并在所有测试第1-4天保持视觉提示不变。将泡沫包装或泡沫放在迷宫周围的地板上以缓冲任何跌落。第1天探险没有逃生箱。
3. 打开ULead视频软件并聚焦相机以获得昏暗的照明。使用相机查看时，确保迷宫位于照片中央，并与房间边缘均匀分开。＆nbsp;
4. 用70％乙醇清洁迷宫并让60秒干燥。
5. 将一勺（约8.8g）大豆婴儿配方粉末加入50ml Falcon管中并用蒸馏水填充。剧烈摇晃，直至配方完全溶解。＆nbsp;
6. 用1毫升混合大豆婴儿配方奶粉填充一个注射器或移液管，并在迷宫的整个面上相当均匀地分散二聚体大小的液滴。
7. 轻轻地将动物带到平台上并将其放置在迷宫装置的中心。让动物探索15分钟。记录动物释放和探测15分钟之间的时间。如果动物跌落，请迅速将其放回迷宫的中心并观察其运动以发现任何伤害。
  注意：如果经常掉落，可以在迷宫边缘周围安装由蛇形汽车皮带或类似材料制成的凸起边框（约1厘米高）。也可以使用迷宫孔内的类似插入物。
8. 用70％乙醇清洁迷宫并替换混合大豆婴儿配方奶粉液滴用于下一只动物。在处理不同动物之间用70％乙醇擦拭带手套的手，以进行此步骤和所有后续步骤。
培训（第2-3天）（图3E）（视频1）

视频1.培训试用
1. 将房间灯设置为最高强度（~525 lux）。
2. 将家笼置于生物安全柜中，并在测试第一只动物之前让动物在家笼中放置15分钟以适应。清洁逃生箱并用70％乙醇迷宫。
3. 训练由5个区块组成，每个区块包含4个试验（仅在第3天立即进行探测后才会进行6个^{th'复习'区块）。试验允许动物60秒定位逃生箱。对于每个块，四个起始位置的顺序随机变化，并且对于在垫料中测试的所有动物保持一致。用一只手握住秒表，将动物放在面向迷宫中心的指定象限，其后爪与逃生孔对齐（图3C）。将动物放入迷宫后，立即移开窗帘后面的视线，观察动物在视频显示屏上的行为。记录动物释放和所有四只爪进入逃生箱之间的时间（图3D）。如果动物未在60秒内找到逃生箱，请将动物的后背上的颈背轻轻地引导其前爪到达逃生孔。在每个块之前用70％乙醇清洁迷宫装置和逃生箱。当最后一只动物完成第1组时，重复第一只动物进行第2组。对于单一动物，一个区块的开始和下一个区块应在15至30分钟内。完成5个训练块后，立即开始探测。}
即时探测（第2-3天）
1. 立即探测用于测试动物在训练后对目标位置的回忆。
2. 在五个训练试验块之后，直接探针是一个60秒的探针。完成五个培训块后，从平台上卸下逃生箱。在与逃生箱位置相对的四个起始位置之一处为探头分配起始位置（图3B）。例如，如果在训练试验期间将逃生箱定位在孔'G'下方，则相反的是起始位置2（S2）。因此，S2将被指定为立即探测的起始位置。相同的探针起始位置用于所有后续探针试验，并在每个垫料中保持一致。通过将动物放置在指定的起始位置开始探测，并允许动物60秒探索迷宫。
  
  图3. Barnes迷宫程序。：一种。实验时间表的布局。 B.带有标记起始位置（S1-S4）的迷宫平台和顺时针方向的逃生孔（A-H）。 C.开始位置下降的图像。 D.在逃生箱内有四个爪子的动物图像，表明分析结束。 E.在训练开始第2天（未经训练），训练结束第3天（训练）和24小时探测器追踪幼年（P23-25）动物的图像。绿色箭头显示释放位置，红色星标记目标位置。
复习块（第3天）
在第3天立即探针后，施用6 th块（4个试验，其具有与块1-5完全相同的逃逸盒）以加强学习。这是为了确保动物在第4天24 HP期间仍然有动力找到逃生地点。
24小时探头（第4天）（图3E）
1. 24小时探针类似于直接探针，但在最终训练期开始后约24小时开始，并用于评估长期空间记忆。
2. 在没有逃生箱的情况下将灯转到最高强度，让动物60秒探索迷宫。

数据分析

使用TopScan分析停留时间，速度，路径长度和到目标的距离。

创建竞技场：这定义了信息区域＆nbsp;
1. 打开TopScan版本2.00。
2. 打开试用版：在左上角，单击摄像机图标并选择一个培训视频文件。需要一个培训课程来创建竞技场。如果迷宫位置不变，可以重复使用竞技场。＆nbsp;
3. 如果圆形迷宫失真，请选择眼睛图标以显示“图像失真校正”框。在“变形选项：”旁边，选择“比例调整H / V：”并键入第一个数字作为平台南北方向的比例，第二个数字作为东部和西部（例如：50/45）并点击“应用”。迷宫不应该是椭圆形的（图S1A ）。
4. 在顶部菜单的“竞技场”下，选择“进入竞技场设计模式”。将出现具有不同形状的工具栏。
5. 在工具栏上，使用单个“点”和“基于中心的圆圈”图标来创建区域：＆nbsp;
  1. 外圈：选择“圆圈”设计工具，并从覆盖整个圆形平台的迷宫中心创建一个圆圈。完成后，选择“完成区域操作”。
    注意：外圈和内圈将在稍后被丢弃，因为它们是模板以创建Octants。
    在右侧的“竞技场设计”框中，在“区域”下将有一个名为“1 CircleCtr”的新区域，其颜色编码与竞技场相匹配。每个新区域将按创建顺序显示（图S1B ）。＆nbsp;
  2. 内圈：在外圈内创建一个较小的圆圈，几乎到达逃生孔。
    注意：稍后将丢弃内圈。
    选择“完成区域操作”（图S1C ）。
  3. 八度：右键单击外圈并选择“分割圆圈”将其平均分为八个部分。旋转八分圆，使逃生孔居中。使用内圆重复此步骤并旋转内八分圆以与外圆周对齐。选择“完成拆分圆”。八分区将在“区域”下标记为“PieCtr”（图S1D ）。
  4. 在“区域”下的右侧“竞技场设计”框中，选择前两个圆圈（外圈和内圈命名为'1 CircleCtr'和'2 CircleCtr'）并删除（图S1E ）。
  5. 逃生孔中心：点击“点”设计工具。使用右击按钮，将一个点放在目标逃生孔的中心，然后选择“设定点位置”（将出现一个绿点）。完成后选择“完成点操作”（点将变为红色）。这将允许测量距离逃生孔的距离以进行Gallagher分析（图S1F ）。
  6. 在“Arena Design”框中，选择“Calibrate”按钮。右键单击迷宫平台的一个边缘，然后选择“第一个校准点”。在迷宫边缘的正对面重做此步骤，然后选择“第二个校准点”。输入校准距离作为迷宫直径（1,200 mm）。完成后，右键单击并选择“完成校准”。这将允许计算机估计迷宫上的距离（图S1G ）。
  7. 定义区域：在“竞技场设计”框中选择“新建”。将弹出“区域定义”框。检查区域并按如下所示命名：＆nbsp;
设置背景：定义动物的追踪位置。
1. 快进视频直到动物在试验开始时独自进入迷宫。
2. 在“背景”下的顶部菜单中，选择“生成背景”。
3. 运行背景生成器直到动物消失。
4. 停止并选择顶部菜单中“背景”下的“保存背景”。
  注意：如果迷宫未被改变且软件能够在没有背景噪音的情况下正确追踪动物，则可以重复使用背景。
5. 或者，从用于分析的相同视频中取出的单个空迷宫帧可以用作背景（“将帧设置为背景图像”）选项。
设置竞技场：选中左侧的“竞技场”并从文件中选择竞技场。
选择“活动”。在“活动规则设置”中，点击“停止规则”标签，然后选择“可用规则列表”下的“持续时间”。在“After Analysis Duration＆gt;”框中键入“60 sec”。这将使分析停止运行超过60秒（图S2A < / A>）。
按下左上角的播放按钮，然后在视频显示实验者释放动物并且手完全脱离迷宫后立即停止。
注意：为防止实验者的手，衣服或阴影受到视频跟踪的干扰，请指示实验者在释放动物后快速撤回手，并向后退一步远离迷宫。
选中“分析”（位于“区域和背景”框上方），然后单击快进并允许视频运行，直到动物到达逃生箱。对于探针试验，允许60秒的分析。
点击左侧“结果”下的“导出”。选择“确定”并保存文本文件。
将Bin文件导出到Excel
1. 单击“Proc”。
2. 在“Proc”中，选择“移动距离”并点击“确定”。＆nbsp;
3. 选择“Velocity”并点击“确定”。＆nbsp;
4. 选择“Dis to Point”，“添加”在竞技场模式“1”中创建的逃生洞点，然后选择“确定”（图S2B ）。
5. 将“Bin Size”更改为1.这将分析每1秒到达点的距离。
6. 选择“导出数据”。
Topscan输出用于量化逃逸潜伏期，路径长度以及最大和平均速度测量。对于探针试验，这些测量是针对第一次目标鼻子戳的路径计算的（通过找到距目标中心的距离首先下降<10cm，然后在视频上进行视觉确认）以及整个60秒试验。每个八分圆的％停留时间也直接来自Topscan输出。相对较短的逃逸潜伏期和目标路径长度以及每个八分圆的较高％停留时间都是优越的迷宫性能的指标。有关这些测量如何与空间导航策略和海马完整性相关的更详细描述，请参阅McHail 等人（2018）。
通过计算动物在顶部视频中观察到的洞内鼻子的次数来手动评分鼻子戳。如果动物将它的鼻子戳在一个洞里，将它取出，然后再将它的鼻子戳在同一个洞里，这算作两个鼻子。在第一个目标鼻子戳之前和之后记录单独的鼻子戳。在第一目标戳之前的鼻子戳的数量可以用于计算误差分数，其也可以基于这些鼻子戳距目标的距离来加权。应用于发育研究的这种评分系统的一个例子可以在McHail 等人（2018）中找到。
McHail 等人报道了年龄大于3周龄的大鼠之间的迷宫表现差异（2018）。

笔记

所有线索都是迷宫外的视觉线索。为了适应幼年视力，相对于用于测试成年动物的视觉线索，视觉线索的尺寸应该更大。
啮齿动物可以追踪自己和其他动物的气味踪迹（Wallace et al。，2002）。为了控制混淆的嗅觉线索（Lavenex和Schenck，1997），建议在块之间旋转迷宫，同时保持目标位置相对于视觉线索固定。在每个区块之前，应使用70％乙醇擦拭迷宫装置和逃生箱（Rosenfeld和Ferguson，2014）。
建议使用背景白噪声，例如来自架空通风系统，以掩盖潜在的听觉线索。
建议测试相同年龄和队列的幼年动物，因为在这个发育阶段表现可能差别很大（McHail et al。，2018）。虽然在Morris水迷宫（Roof and Stein，1999）中报告了成年大鼠的性别差异，但在Barnes迷宫中没有观察到青春期前大鼠表现的性别差异（Ojeda和Urbanski，1994; McHail et al 。，2018）。

致谢

该方案用于我们先前的研究中以分析幼年大鼠的空间导航（P17-P25）（McHail 等人，，2018）。作者感谢Richard H. Ogoe，Diyi Chen，Amir Behsudi和Celeste Chong的技术支持。这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）国家老龄化研究所（NIA）通过Grant 1R15AG045820-01A1和乔治梅森大学克拉斯诺高级研究所的支持。

利益争夺

作者声明没有利益冲突。

伦理

所有程序均按照国家研究委员会“实验动物护理和使用指南”中规定的规定进行，并经乔治梅森大学机构动物护理和使用委员会批准。

参考

Albani，S.H.，McHail，D.G。和Dumas，T.C。（2014）。海马和海马依赖行为的发展研究：来自跨学科研究的见解和新研究人员的提示。 Neurosci Biobehav Rev 43：183-190。
Barnes，C.A。（1979）。与衰老相关的记忆缺陷：大鼠的神经生理学和行为学研究。 J Comp Physiol Psychol 93（1）：74-104。
Gallagher，M.，Burwell，R。和Burchinal，M。（1993）。老龄化空间学习障碍的严重程度：制定Morris水迷宫中的表现学习指标。 Behav Neurosci 107（4）：618-626。
Lavenex，P。和Schenk，F。（1997）。嗅觉提示可以加强对遥远的视觉空间信息的学习。 Neurobiol Learn Mem 68（2）：140-153。
McHail，D.G.，Valibeigi，N。和Dumas，T.C。（2018）。少年大鼠的巴恩斯迷宫描绘了空间导航能力的出现。学习记忆 25（3）：138-146。
Morris，R。（1984）。开发用于研究大鼠空间学习的水迷宫程序。 J Neurosci Methods 11（1）：47-60。
Ojeda，S.R。和Urbanski，H.F。，（1994）。大鼠青春期。 “生殖生理学”，第363-409页。
Rosenfeld，C。S.和Ferguson，S。A.（2014）。使用小型和大型啮齿动物模型的Barnes迷宫测试策略。 J Vis Exp （84）：e51194。
Wallace，D.G.，Gorny，B。和Whishaw，I.Q。（2002）。老鼠可以追踪气味，其他老鼠和自身：对空间行为研究的影响。 Behav Brain Res 131（1-2）：185-192。