材料和试剂

骨肉瘤细胞（Basu-Roy等人，2012）
来自Invitrogen（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：11330-032）的DMEM-高葡萄糖
胎牛血清（FBS）
青霉素 - 链霉素
β-甘油磷酸酯（Sigma-Aldrich，目录号：G9422）
抗坏血酸（Sigma-Aldrich，目录号：A4034）
来自Invitrogen（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：14155-063）的Earle's平衡盐溶液（EBSS）
HCl
乙醇
DMSO（Sigma-Aldrich，目录号：D8418）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
多聚甲醛
异丙醇
丙酮
双蒸馏H 2 O（ddw）
柠檬酸浓溶液（20ml）（Sigma-Aldrich，目录号：854℃）
萘酚AS-MX磷酸盐碱性溶液，0.25％（20ml）（Sigma-Aldrich，目录号：855）
Fast Blue RR盐（Sigma-Aldrich，目录号：FBS25-10 CAP）的完全胶囊
油红O（Sigma-Aldrich，目录号：O0625）
Mayer's HemTox染料（Sigma-Aldrich，目录号：MHS1）
生物染色委员会认证的茜素红S（Sigma-Aldrich，目录号：A5533）
β-甘油磷酸盐储备溶液（见配方）
1,000x抗坏血酸溶液（见配方）
地塞米松（Sigma-Aldrich，目录号：D4902）（参见Recipes）
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）（Sigma-Aldrich，目录号：I5879）（参见Recipes）
吲哚美辛（Sigma-Aldrich，目录号：I8280）（参见Recipes）
胰岛素（重组人）（Sigma-Aldrich，目录号：I2643）（参见Recipes）
固定解决方案（参见配方）
成骨的染色溶液（参见配方）
油红O储备溶液（见配方）
矿化成骨细胞染色溶液（参见配方）

设备

组织培养设置
巴斯德移液器
巴斯德吸头
光学显微镜
Pall Life Sciences acrodisc ayringe filter（0.2μMHT Tuffryn membrane low-protein binding non-pyogenic）（Life Sciences，目录号：PN 4192）
0.2μM尼龙滤膜
24孔板

程序

电镀细胞进行分化
1. 在DMEM/10％FBS /青霉素 - 链霉素中的24孔板中每孔铺板50,000-60,000个骨肉瘤细胞。这可能是你感兴趣的细胞系。根据您的细胞系更换培养基利息
2. 第二天或当他们达到汇合（通常在36 h），切换到分化培养基。通常细胞不分化，除非他们至少80-90％汇合。所有分化培养基是补充有步骤3和4中所示的分化混合物的常规DMEM/10％FBS/PS
3. 对于骨形成，使用10mMβ-甘油磷酸酯和100μg/ml抗坏血酸。这是最终浓度。
4. 对于脂肪生成，使用10μg/ml胰岛素，100nM地塞米松，250μMIBMX和200μM吲哚美辛。这些是最终浓度。如何制作股票将在后面描述
5. 每2-3天使用新鲜分化培养基饲养细胞，每次在喂养期间。当喂食时，确保用于吸液介质的巴斯德吸管尖端不会接触细胞层，因为细胞在分化过程中，特别是在脂肪形成过程中松动。
6. 在2，5，8，10，12和15天，对成骨和成脂细胞进行染色
碱性磷酸酶测定以测量成骨细胞分化这是比色测定，其中黄色底物。 4-苯甲酰氨基-2,5-二甲氧基重氮氯化氯半（氯化锌）盐，偶氮二偶氮No.24由碱性磷酸酶水解，得到紫色染料沉淀。
在开始测定前准备固定溶液和染色溶液。保护解决方案免受光保护剂制备。
1. 板在分化培养基中需要细胞（在24孔板中通常为50,000个细胞/孔）
2. 在指定时间从分化培养基中铺板的细胞中吸出培养基
3. 用1x PBS洗一次。每次洗涤步骤包括加入1×PBS，然后吸出
4. 每孔加入1ml固定液，室温孵育1分钟
5. 用1x PBS洗孔一次。
6. 每孔加入1ml染色溶液
7. 在室温下在黑暗中孵育30分钟并检查显色。孔中紫色染色区域的发展表明阳性反应。如果需要，在室温下继续反应另外30分钟。记录增加的孵育时间。不超过1小时。
8. 停止反应，用dd水或自来水快速洗涤。
9. 在进行茜素红S染色以进行矿化之前，不要忘记拍照板
茜素红S染色检测矿化
茜素红S是钙敏感染料。分化的成骨细胞沉积大量的细胞外钙（矿化的标志），其可以通过与茜素红S络合检测。钙沉积物显示为明亮的橙红色染色区域。
1. 在拍摄用碱性磷酸酶染色的平板后，通过用1×PBS洗涤染色的平板两次，进行茜素红S染色，所述PBS用0.1％NH 4 OH调节其pH至4.2。
2. 吸出PBS，并添加足够的茜素红S染色溶液覆盖细胞单层。将板在室温下在黑暗中孵育45分钟
3. 小心吸出茜素红S溶液，并洗涤板四秒钟，然后用蒸馏水
4. 细胞外钙沉积物呈现为明亮染色的橙红色区域
油红O染色测定脂肪形成分化该染色测定基于如下原理：亲脂性染料油红O保留在脂肪细胞的脂肪球中，其可以在显微镜下观察到。
1. 吸出培养基并在PBS中洗涤细胞一次
2. 在室温下将细胞固定在4％PFA中15分钟
3. 用ddH 2 O 2洗涤两次，每次2×5分钟
4. 用油 - 红-O工作溶液在室温下染色15分钟
5. 用1x PBS或ddH 2 O洗涤3×5分钟
6. 在室温下用50％异丙醇冲洗细胞一次。
7. 用1×PBS或ddH 2 O漂洗细胞
8. 红色染色的脂滴可以通过光学显微镜可视化。脂肪细胞也可以通过其圆形形态在正常显微镜下容易地显现，并且显着增强较大脂滴的光反射。
9. 计数总细胞，用Mayer's HemTox染色在室温下染色15分钟，用dd水洗涤2x

食谱

β-甘油磷酸酯可以通过制备100倍的1M溶液的储液来制备。预热水易溶解。化合物的配方重量取决于水合程度，并且可以通过使用瓶上提供的批号来确定。使用Pall Life Sciences Acrodisc注射器过滤器过滤。制成1毫升等分试样，在-20℃下冷冻
1,000x抗坏血酸溶液可以通过将1克抗坏血酸溶解在10ml ddw（双蒸水）中制备。使用Pall Life Sciences Acrodisc Syringe过滤器过滤。制成1毫升等分试样，在-20℃下冷冻
地塞米松（FW 392.5）
将0.0196g溶于10ml无水乙醇中，得到5mM储备液;存储在-80°C。通过在100％乙醇中稀释至100μM制备新鲜的工作原料
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）（FW 222.2）
将100mg IBMX溶解在1.8ml DMSO中并通过0.2μM尼龙过滤器无菌过滤以制备250mM储备液（1,000x）。分装并储存在-20°C或以下
吲哚美辛（FW 357.8）
将0.5367g吲哚美辛溶解在7.5ml DMSO中，并通过0.2μm尼龙过滤器过滤以灭菌200mM（1,000x）原液。分配1-2毫升等分在无菌冷冻管，并存储在不透明的盒子，以保护免受光。储存于-70°C或更低温度
胰岛素，重组人类
将50mg胰岛素溶解在用50μl0.005N HCl酸化的10ml EBSS中以产生500x储备液，并进行无菌过滤。不要忘记使用低蛋白结合过滤器，如设备中所述。将1ml等分试样分装在无菌冷冻管中，并在-70℃或更低温度下储存长达2年。解冻后，工作原液可以在4°C下储存长达1个月。或者，无菌过滤器酸化EBSS，并使用无菌溶液在无菌条件下制造胰岛素
成骨固定溶液
20ml dd水+ 30ml丙酮+400μl柠檬酸盐浓缩溶液
成骨染色溶液
48ml dd水+ 2ml萘酚AS-MX磷酸盐碱性溶液，0.25％+ 1个完整的快蓝色RR盐胶囊
用于染色脂肪细胞的油红O原液将500mg油红O溶于100ml异丙醇中。对于工作股票，稀释股票作为2份dd水+ 3份油红O股票。摇动，室温孵育15分钟，使用Pall Life Sciences Acrodisc Syringe过滤器过滤。在1小时内准备使用。
矿化成骨细胞染色溶液
将2g茜素红S溶解在100ml蒸馏水中，混合，并用0.1％NH 4 OH调节pH至4.2以制备茜素红S染色溶液。使用Pall Life Sciences Acrodisc Syringe过滤器过滤深棕色溶液。并把它存放在黑暗的箔箔覆盖或琥珀色的瓶子。
注意：溶液的正确pH是至关重要的。该溶液在室温下稳定2-3周。如果您打算在一个月后使用它，请检查pH值以确保pH仍然为4.2。

致谢

该调查得到来自NIAMS的PHS Grants AR051358和来自NIDCR的DE013745以及通过NCI UO1奖（SHO）的支持。 UBR是来自儿童癌症研究基金的一个研究金的收件人，纪念Dr Rausen博士。 AM是来自圣巴德里克基金会的研究资助的收件人。 JAP是美国癌症协会的博士后研究员。 SHO是霍华德休斯医学研究所的研究员。该协议与Basu-Roy等人的文章（2012）相关联。

参考文献

Basu-Roy，U.，Seo，E.，Ramanathapuram，L.，Rapp，T.B.，Perry，J.A.，Orkin，S.H.，Mansukhani，A.and Basilico，C。（2012）。 Sox2维持骨肉瘤肿瘤起始细胞的自我更新。癌基因 31（18）：2270-2282。