材料和试剂

慢病毒载体一代
1. pLVX Lenti-X Tet-One诱导表达系统（Clontech，目录号：631847）
2. FWD seq ：taaaccagggcgcctataaa（IDT定制底漆）
3. REV seq ：taggcagtagctctgacggc（IDT自定义引物）
4. Bam HI（NEB，目录号：R3136S）
5. Eco RI（NEB，目录号：R3101S）
6. 小牛肠道碱性磷酸酶（CIAP; NEB，目录号：M0290S）
7. 用于PCR扩增的高保真DNA聚合酶（例如，Platinum PCR SuperMix，Invitrogen，目录号：12532-016或PfuTurbo DNA Polymerase，Agilent Technologies，目录号：600252）
8. In-Fusion HD酶（Clontech，目录号：638910）
9. QIAquick凝胶萃取柱（QIAGEN，目录号：28704）
10. 氨苄青霉素100mg / ml（溶于ddH 2 O并过滤灭菌）
11. 小规模质粒DNA纯化QIAprep Spin Miniprep试剂盒（QIAGEN，目录号：27104）
12. 大规模质粒DNA纯化Maxi试剂盒（QIAGEN，目录号：12163）
13. 酵母抽提物
14. 胰蛋白胨
15. 氯化钠
16. 2YT媒体（见食谱）
慢病毒颗粒包装
1. 注射器
2. 0.45μm过滤器
  注意：确保使用低蛋白结合，例如Millex-HV Filter PVDF（Millipore，目录号：SLHVM33RS），以防止病毒颗粒与膜结合并丢失。
3. 100毫米培养皿
4. Amicon Ultra-15（Millipore，目录号：UFC903024）
5. HEK293T细胞系（ATCC，目录号：CRL-3216）
6. 包装质粒（分别来自Addgene的pMD2.G和psPAX2，目录号：12260和12259）进行转化和纯化（例如，Maxi kit，QIAGEN，目录号：12163）
7. 转染试剂TransIT-LT1（Mirus MIR，目录号：2305）
8. Dulbecco's Modified Eagle's Medium（DMEM，Sigma-Aldrich，目录号：D6171）
慢病毒颗粒转导和滴定
1. ＆nbsp; 6孔培养板
2. LNCaP细胞系（ATCC，目录号：CRL-1740）
3. RPMI-1640培养基（Sigma-Aldrich，目录号：R5886）
4. 200 mM L-谷氨酰胺（Invitrogen）
5. 胎牛血清（Gibco）
6. Hexadimethrine bromide（Polybrene，Sigma-Aldrich，目录号：H9268）
7. 嘌呤霉素二盐酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：P9620）
8. 水晶紫
诱导基因表达
1. 10％乙醇
2. 单克隆抗侧标M2-过氧化物酶（HRP）抗体（西格玛奥德里奇，目录号：A8592）
3. 强力霉素（Sigma-Aldrich，10 mg / ml）
4. 4％福尔马林
离体组织制备和转导
1. 手术刀或手术刀片
2. 疏水笔（DAKO）
3. 100％乙醇
4. 媒体（RPMI-1640，Sigma-Aldrich，目录号：R5886）
5. 明胶海绵（Spongostan，Johnson＆amp; Johnson，目录号：1364245）
6. 抗真菌溶液（Sigma-Aldrich，目录号：A5955）
7. 10μg/ ml氢化可的松（Sigma-Aldrich）
8. 来自牛胰腺的10μg/ ml胰岛素溶液（Sigma-Aldrich，目录号：I0516）
9. Hexadimethrine bromide（Polybrene，Sigma-Aldrich，目录号：H9268）
10. 强力霉素（10 mg / ml）
11. 牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich）
12. HRP偶联的二抗
  ImmPRESS TM HRP抗兔IgG（Vector Laboratories，目录号：MP-7401）
  ImmPRESS TM HRP抗小鼠IgG（Vector Laboratories，目录号：MP-7402）
13. ImmPACT DAB过氧化物酶（HRP）底物（Vector Laboratories，目录号：SK-4105）
14. 二甲苯
15. DPX安装介质（Sigma）
16. 不含四环素的FBS（Clontech，目录号：631106）
免疫组织化学染色增殖标记物
1. 增殖标志物的一抗：H3S10 phos （Millipore，目录号：06-570）
2. Antigen Retrieval Buffer（100x Citrate Buffer pH 6.0）（例如，Abcam，目录号：ab93678）
3. 的NaHCO <子> 3
4. 硫酸镁<子> 4
5. 苏木
6. 斯科特的自来水替代品（见食谱）
7. Gill的苏木精II解决方案（见食谱）

设备

移液器（例如，Gilson）
PCR机
CO 2 培养箱
Decloaker
切片机切片石蜡块
冰箱
振动器

软件

Aperio成像系统（ https://www.leicabiosystems.com/digital-pathology/scan/）

程序

慢病毒载体世代（定时1-2周）
1. 通过PCR扩增感兴趣的基因以使用基因特异性引物插入pLVX中：
  1. Fwd ccctcgtaaaGAATTC xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx
  2. Fwd cgactacgccGGATCC xxx xxx xxx xxx xxx xxx xxx如果使用pLVX-FLAG / HA（McClurg et al。，2018）
  3. Rev ccctcgtaaaGAATTC yyy yyy yyy yyy yyy yyy yyy
2. 组装PCR反应：
  模板DNA0.1μg
  Platinum PCR SuperMix45μl
  2μlFwd引物10μM
  2μlRev底漆10μM
  添加ddH 2 O至最终体积为50μl
3. 运行PCR程序：
  在95°C下变性5分钟
  25个周期：
  变性 - 在95°C下30秒
  退火 - 在55°C时30秒
  延长 - 在68°C时每1,000 bp PCR产物1分钟
  最终延伸至68°C
  降至4°C并无限期保持在4°C
  暂停点：PCR产物可在-20°C下保存数月。（见表1- [1]）
4. 通过用 Bam HI和 Eco RI（或仅 Bam <）消化2-10μg纯化质粒，线性化pLVX（或根据要求提供pLVX-FLAG / HA） em> HI，如果使用pLVX-FLAG / HA）在37°C下按照制造商的说明进行30-60分钟（参见Michael和Joseph [2012]，如果此步骤或后续步骤需要更多背景信息）。然后，通过在1％琼脂糖凝胶上运行凝胶纯化，切割~9,300bp片段，溶解于600μlQIAGEN增溶缓冲液中，施加于柱上，以最大速度旋转1分钟，除去滤液，用700μlQIAGEN洗涤缓冲液洗涤，以最大速度旋转1分钟，去除滤液，最后一次以最大速度旋转1分钟，施加50μl50μMTris-Cl pH 7.5洗脱缓冲液，静置2-5分钟，以最大速度旋转1分钟，去除柱，并保留纯化的pLVX线性化质粒DNA。
  暂停点：线性化的pLVX DNA可在-20°C下保存数月。
5. 通过与In-Fusion HD酶重组（遵循制造商的说明书）将PCR产物插入pLVX载体中。
6. 使用标准程序转化感受态DH5α细菌细胞。
7. 使用QIAGEN QIAprep Spin Miniprep试剂盒纯化DNA
  注意：如果需要，确保通过基因特异性引物测序验证构建体以及pLVX FWD seq （taaaccagggcgcctataaa）和REV seq （taggcagtagctctgacggc）引物。
  暂停点：纯化的质粒可以无限期保存在-20°C直至准备好。
8. 转化DH5α中的阳性克隆。早上挑选菌落，接种2 ml 2YT培养基（补充100μg/ ml氨苄青霉素），在摇床（200-250 rpm）中于37°C孵育约6-8 h，然后放大至250 ml 2YT培养基（补充有100μg/ ml氨苄青霉素），并在37℃下回到振荡器（200-250rpm）过夜。
9. 根据制造商的说明使用QIAGEN Maxi试剂盒纯化质粒DNA
  暂停点：纯化的质粒可以无限期保存在-20°C，直到准备好包装慢病毒颗粒。
慢病毒颗粒包装（定时5天）
1. 转染前一天，在10ml完全DMEM中，在100mm培养皿（每个pLVX构建体1个）中培养2-300万个HEK293T细胞。细胞太少或太多将导致转染不良和低慢病毒颗粒产量。
2. 第二天，准备每个pLVX构建体转染1ml无血清培养基和54μlLT1试剂。将培养基-LT1混合物在室温下孵育15分钟。在此期间，将9μgpLVX与6.75μgpsPAX2和2.25μgpMD2.G混合。向DNA中加入1ml培养基-LT1混合物，并在室温下进一步孵育30分钟。从培养箱中取出HEK293T培养皿，并将培养基-LT1-DNA混合物逐滴添加到细胞中。将HEK293T培养皿放回培养箱中过夜（12-18小时）。第二天，取出培养基（~10 ml），换上5-6 ml新鲜DMEM（补充剂，如FBS，谷氨酰胺和抗生素）。
3. 24小时和48小时后，收集培养基（含有慢病毒颗粒 - 病毒上清液），用5-6ml新鲜DMEM补充并储存在冰箱中。收集病毒上清液后，应使用注射器和0.45μm过滤器（Millex-HV过滤器PVDF; Millipore）过滤病毒（基本上是为了去除漂浮的HEK293T细胞）。
  注意：确保使用指定的低蛋白结合0.45μm过滤器，否则病毒颗粒可能会与过滤器结合，从而大大降低病毒滴度。
  暂停点：病毒颗粒可以在冰箱中储存数月，等分并储存在-20或-80°C，或浓缩并储存在-80°C。
慢病毒转导和滴定（定时5天）
1. 在第0天，以6孔板的每孔100,000个细胞接种LNCaP细胞。
2. 在第1天，按照连续稀释方案（例如，2,000μl（稀释因子1），200μl（10），20μl（1 x 10 2 <）向每个孔中添加慢病毒颗粒。 / sup>），2μl（1×10 3 ），0.2μl（1×10 4 ）和0μl未转导的对照）。将病毒颗粒留在细胞上过夜（约18小时）。
3. 在第2天，取出含有慢病毒的培养基，换上新鲜的完整RPMI-1640培养基。
4. 在第3天，以1μg/μl终浓度向每个孔中加入嘌呤霉素。
5. 在第5天，取出培养基并使用溶解在10％乙醇中的1％结晶紫（足以覆盖平板）固定并染色细胞。用蒸馏水洗几次污渍并计数菌落。感染复数（MOI）使用以下公式估算：
  
  MOI =菌落数X病毒稀释因子（见表1- [2]）
  
  注意：尽量避免冻融慢病毒原种，因为这可能会降低MOI。值得注意的是，我们观察到慢病毒上清液在4°C下相对稳定数月，而MOI没有明显损失。
离体组织制备和转导（定时1-2周）
1. 根据当地法规和相关实体的道德批准，从无癌患者获得良性前列腺增生（BPH）样本。在患者同意后通过外科手术取出BPH样品，并将其置于足够的冰冷RPMI1640培养基中，不添加补充物以覆盖样品。
2. 在手术后24小时内，将组织切开至1mm 3 片并在明胶海绵（Spongostan，Johnson＆amp; Johnson）上一式两份地培养，所述明胶海绵预先浸泡在补充有1x抗真菌溶液（Sigma）的培养基中。，10μg/ ml氢化可的松，和来自牛胰腺（Sigma），多西环素和慢病毒颗粒的10μg/ ml胰岛素溶液。
3. 在实验结束时（24-72小时），立即将样品置于4％福尔马林中24小时，然后在乙醇中处理，接着是二甲苯，最后是石蜡包埋。
  暂停点：一旦固定并嵌入石蜡中，离体组织可以无限期地在室温下储存。
  注意：在预先浸泡海绵的阶段，将含有培养基和强力霉素的慢病毒颗粒添加到培养基中以确保它们穿透海绵并到达外植体是至关重要的。（见表1- [3]）
免疫组织化学染色增殖标记物（定时2天）
1. 切片福尔马林固定石蜡包埋组织，然后在60°C烘烤2小时。
2. 通过在三个连续的二甲苯罐中孵育5分钟使组织脱蜡。
3. 通过在100％乙醇中连续孵育1分钟三次来水合组织，然后是95％乙醇，70％乙醇，50％乙醇，最后是水。
4. 在decloaker中在125℃下回收柠檬酸盐缓冲液中的抗原30秒。
5. 通过将冷却的载玻片在3％H 2 O 2 溶液中温育10分钟来灭活内源性过氧化物酶，然后在水中洗涤载玻片并在10分钟内阻断非特异性蛋白质结合位点在TBS中1％BSA中孵育。使用疏水笔（DAKO）在组织周围做标记。
6. 将载玻片在1％BSA中稀释的第一抗体中孵育，每个部分200μl，在4℃下在湿室中过夜。
7. 将载玻片在TBS中洗涤两次，每次5分钟，同时轻轻搅拌。
8. 将载玻片在HRP缀合的第二抗体（ImmPRESS TM HRP抗兔IgG; ImmPRESS TM HRP抗小鼠IgG）中孵育30分钟。
9. 在流动的自来水中洗涤10分钟，洗去未结合的抗体。
10. 将载玻片在1x DAB（ImmPACT DAB过氧化物酶底物SK-4105）的工作溶液中孵育5分钟，然后用5分钟水洗涤。
11. 用Gill苏木精II对染色细胞核15秒，然后用水洗涤，在斯科特水中孵育30秒，然后用水洗涤。
12. 将组织脱水1分钟，依次浸入50％乙醇，70％乙醇，95％乙醇和3次100％乙醇中。
13. 将载玻片在三个连续的二甲苯容器中孵育3分钟。
14. 根据制造商的说明将载玻片安装在DPX（Sigma）中，并使其干燥24小时。
15. 在显微镜下观察载玻片（光学）或在Aperio上扫描。
16. 可以使用Aperio成像系统自动对染色进行评分。
  暂停点：切割和烘烤后，载玻片可以存放几周。染色后，载玻片稳定，可无限期保存（见表1- [4]）。
  注意：重复水化后，染色过程中任何时候都不要弄干组织。控制载玻片仅用二抗染色至关重要（见表1- [4]）。

笔记

故障排除建议见下表1。

表1.故障排除建议
离体转导组织的实例可以在McClurg 等人（2018）中找到。

数据分析

理想情况下，应分析来自至少3名患者（n = 3）的样本，并由2名经过培训的病理学家独立评分IHC。

食谱

2YT媒体
10克酵母提取物
16克胰蛋白胨
5克NaCl
溶于1,000ml ddH 2 O中并高压灭菌
斯科特的自来水替代品
2 g / L NaHCO 3
20g / L MgSO 4
Gill的苏木精II解决方案
4 g / L苏木精

致谢

对于这项工作，OB得到纽卡斯尔生物医学奖学金计划的支持，该计划的部分资金来自Wellcome Trust的机构战略支持基金，以及乳腺癌运动慈善基金2013MaySP005。 ULM得到JGWP基金会（BH142412），纽卡斯尔医疗慈善机构（JG / ML / 0414），英国前列腺癌（PG09-23）和英国癌症研究中心（C27826 / A15994）的支持。 KR得到了加拿大卫生研究院的支持（CIHR资助MOP-311094）。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或竞争利益。

伦理

正如最初的出版物（McClurg et al。，2018）所述，良性前列腺增生（BPH）样本是从Freeman医院病理科（泰恩河畔纽卡斯尔）建立的无癌患者中获得的。，英国）。组织样品获得Newcastle＆amp; Co.的完全伦理批准。 North Tyneside 1 NHS战略卫生局地方研究伦理委员会（参考15 / NE / 0400）和患者的书面知情同意书。

参考

癌症基因组图谱研究，N。（2015）。原发性前列腺癌的分子分类。细胞 163 （4）：1011-1025。
Centenera，MM，Gillis，JL，Hanson，AR，Jindal，S.，Taylor，RA，Risbridger，GP，Sutherland，PD，Scher，HI，Raj，GV，Knudsen，KE，Yeadon，T.，Australian Prostate Cancer， B.，Tilley，WD和Butler，LM（2012）。通过离体人类培养揭示新Hsp90抑制剂功效的证据前列腺肿瘤。 Clin Cancer Res 18（13）：3562-3570。
Centenera，M。M.，Raj，G。V.，Knudsen，K。E.，Tilley，W。D. and Butler，L。M.（2013）。离体培养人类前列腺组织和药物开发。 Nat Rev Urol 10（8）：483-487。
Feldman，B。J.和Feldman，D。（2001）。雄激素非依赖性前列腺癌的发展。 Nat Rev Cancer 1（1）：34-45。
McClurg，UL，Nabbi，A.，Ricordel，C.，Korolchuk，S.，McCracken，S.，Heer，R.，Wilson，L.，Butler，LM，Irving-Hooper，BK，Pedeux，R.，Robson ，CN，Riabowol，KT和Binda，O。（2018）。人离体前列腺组织模型系统将ING3识别为癌蛋白。< / a> Br J Cancer 118（5）：713-726。
Michael，R。G.和Joseph，S。（2012）。分子克隆：实验室手册。第4版。冷泉港，N.Y。冷泉港实验室出版社。