材料和试剂

1.5毫升Eppendorf管（Eppendorf）
10μl，200μl和1 ml移液器吸头（FUKAEKASEI和WATSON，目录号：1201-705C）
24孔板（康宁，目录号：3526）＆nbsp;
6孔板（康宁，目录号：353046）
6厘米培养皿（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：150288）
注射器＆NBSP;
75厘米烧瓶（T75烧瓶）（Corning，目录号：430641U）
0.22μm过滤器（Axiva Sichem Biotech，目录号：SFPV13 R）
铅笔
BALB / c小鼠（6-8W，雌性）
293T细胞（ATCC，目录号：CRL-3216）
MDCK细胞（ATCC，目录号：CCL-34）
A / WSN / 33（H1N1）（WSN）病毒（Hoffmann et al。>，2000）
A / Sichuan / 1/2009（H1N1）（SC09）（由Yuelong Shu教授在中国CDC提供）
TCP（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-208452）
1x PBS（Lonza，目录号：17-516Q）
异氟醚（雅培，目录号：5260-04-05）
苦味酸（Fisher Scientific，目录号：13205）（用于标记小鼠）
DMEM（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：11965092）
多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
真蓝基材（KPL，目录号：50-78-02）
抗核蛋白抗体（上海生命科学研究院抗体研究中心）
抗兔IgG二抗（上海生命科学研究院抗体研究中心）
Avicel（FMC BioPolymer，目录号：CL 611）
牛血清白蛋白（BSA）（西格玛奥德里奇，目录号：A3912）
2x DMEM（Thermo Fisher Scientific，目录号：12800017）
胰蛋白酶（TPCK）（Sigma-Aldrich，目录号：4370285）
胎牛血清热灭活（FBS）（西格玛奥德里奇，目录号：F9665）
Bacto TM 琼脂（BD，Bacto TM ，目录号：214010）
18MΩH 2 O.
覆盖介质（DMEM + 2％FBS + 0.9％Bacto TM -Agar）
感染培养基（DMEM +1μg/ ml TPCK）
反式-2-苯基环丙胺盐酸盐（TCP）（1 mg / ml）（见食谱）
2.4％Avicel（见食谱）
6％BSA（见食谱）
叠加媒体（见食谱）

设备

移液器（Thermo Fisher Scientific，目录号：1156-6963）
解剖设备（镊子，镊子，剪刀）
麻醉机（Parkland Scientific，目录号：V3000PK）
Eppendorf离心机
II级生物安全罩（赛默飞世尔科技）
恒温箱
冷冻箱（4°C，-20°C和-80°C）
紫外线（UV）光

软件

GraphPad Prism（ https://www.graphpad.com/ ）＆nbsp;
统计产品和服务解决方案（SPSS）（ https：// www.ibm.com/analytics/data-science/predictive-analytics/spss-statistical-software ）

程序

病毒制作
如先前在生物安全性2级罩中所述通过反向遗传学产生WSN病毒（Hoffmann 等人，>，2000）。 A / Sichuan / 1/2009 [H1N1] [SC09]病毒由中国疾病预防控制中心的岳跃蓉教授友情提供。
1. 转染和转导
  1. 按照制造商的方案，在6cm培养皿中转染单层293T细胞，其中各8μg质粒pHW2000-WSN-segment1-8（由德国Hans Klenk教授提供）各1μg。
  2. 转染后24小时，将培养基更换为含有2％FBS的4ml DMEM，并在37℃再培养48小时。＆nbsp;
  3. 将转染的293T细胞中的所有上清液转移到6cm培养皿中的单层MDCK细胞中，如果整个体积小于4ml，则用含有2％FBS的新鲜DMEM填充。＆nbsp;
  4. 将MDCK细胞培养48-96小时直至观察到CPE。收集MDCK上清液并制备原种。
2. 斑块净化
  1. 在PBS中连续10倍稀释稀释原液上清液，并将300μl每种稀释液施加到在6孔板中铺板的单层MDCK细胞的指定孔中0.5小时。＆nbsp;
  2. 此后，丢弃残留的培养基并在PBS中洗涤细胞2次。然后在细胞上加入2ml覆盖培养基（DMEM + 2％FBS + 0.9％Bacto TM -Agar），培养细胞2-3天，观察斑块。＆nbsp;
  3. 用铅笔从下面环绕牙菌斑，用1毫升移液管尖端从顶部取一块牙菌斑，然后将菌斑重悬于1毫升PBS中，4℃下16小时。这种1毫升含有病毒的PBS将被用作第一轮斑块，以便第二次重复斑块净化。＆nbsp;
  4. 对产生的病毒进行测序并在75cm烧瓶中在MDCK细胞中繁殖以制备病毒原种。
病毒扩增和病毒滴度测定
1. 病毒扩增
  1. 在T75烧瓶中种子单层的MDCK细胞，在12小时后细胞应该是80％汇合的。然后在15ml感染培养基（DMEM +1μg/ ml TPCK）中用MOI = 0.001的病毒感染细胞。＆nbsp;
  2. 当细胞几乎死亡（约3天）时收集病毒上清液。在1,000 x g >下离心10分钟，将上清液分装并保持在-80°C。
2. 通过噬斑测定确定病毒滴度（Matrosovich 等>。，2016）
  1. 在12小时细胞后，24孔板中MDCK细胞的单层种子应该是100％汇合的。＆nbsp;
  2. 然后用200μl病毒上清液感染细胞，所述病毒上清液通过DMEM进行10倍连续稀释。＆nbsp;
  3. 在37℃，5％CO 2 中孵育1小时后，除去培养基并用1x PBS洗涤一次。＆nbsp;
  4. 然后加入2ml覆盖培养基以覆盖MDCK细胞并孵育2天，随后将细胞固定在4％多聚甲醛中并暴露于紫外（UV）光下30分钟。
  5. 使用抗核蛋白多克隆一抗在室温下进行免疫染色1小时，并在室温下用HRP缀合的抗兔IgG二抗进行2小时的免疫染色。＆nbsp;
  6. 最后，添加100μlTrueBlue底物以显现斑块。
半数致死剂量的测量
1. 将小鼠（6-8周龄的BALB / c小鼠）转移至ABSL2以进行适应性喂养3-7天。将小鼠（6-8周龄的BALB / c小鼠）随机分成四组以感染不同浓度的甲型流感病毒，每组4只小鼠。
2. 在50μl不同浓度的PBS中稀释病毒（4 x 10 4 pfu /小鼠，4 x 10 3 pfu /小鼠，4 x 10 2 pfu /小鼠，4×10 1 pfu /小鼠）用于WSN和（9×10 5 pfu /小鼠，1.3×10 5 对于SC09（H1N1）菌株，pfu /小鼠，1.3×10 4 pfu /小鼠，1.3×10 3 pfu /小鼠）。＆nbsp;
3. 用异氟烷麻醉小鼠并用含有在PBS中稀释的不同浓度病毒的50μl小滴鼻内感染小鼠。
4. 在第0天至第14天的整个感染时间过程中监测小鼠的体重和死亡（图1）。
5. 通过统计产品和服务解决方案（SPSS）计算半数致死剂量
  要在SPSS中运行概率单位分析，我们按照以下步骤操作：首先，在数据编辑器中输入至少三列（每个容器响应的个体数，每个容器的个体总数，浓度）。其次，在设置列之后，转到分析，然后按回归，然后按probit。第三，将您的号码响应列设置为“响应频率”，将每个容器的总数设置为“总观察值”，将浓度设置为“协变量”。不要忘记选择对数基数10来转换浓度。按“确定”，然后获得LD50结果。
  
  图1.探索WSN和SC09的半数致死剂量。小鼠随机分为4组，不同剂量的H1N1用于感染小鼠。在第0天至第14天（A和C）的整个感染时间过程中监测小鼠的体重。小鼠的存活曲线显示在B和D中。
用不同剂量的不同剂量病毒感染小鼠
为了探讨TCP对小鼠体重减轻和死亡率的影响，我们用致死剂量的病毒感染小鼠，看看TCP的治疗是否可以挽救或恶化疾病。为此，我们用10,000 pfu剂量的WSN（约5LD50）病毒感染小鼠，以保证致命的感染。（Shan et al。>，2017年的图4A和4B）
1. 将小鼠（6-8周龄的BALB / c小鼠）转移至ABSL2进行适应性喂养3-7天。＆nbsp;
2. 将小鼠（6-8周龄的BALB / c小鼠）随机分成四组：PBS模拟组，TCP模拟组，PBS-WSN处理组和TCP-WSN处理组。
3. 在50μlPBS中稀释10,000 pfu的WSN。
4. 用异氟醚麻醉小鼠并用含有在PBS中稀释的不同浓度病毒的50μl小滴鼻内感染小鼠。
5. 每天一次腹膜内注射1mg / ml TCP（100μl/小鼠）和PBS（100μl/小鼠），持续10天。
6. 在第0天至第14天的整个感染时间过程中监测小鼠的体重和死亡（Shan 等人的图4A和4B，2017）。
在我们知道TCP加速疾病之后，我们决定用亚致死剂量的病毒感染小鼠，500 pfu的WSN病毒（0.25LD50）（图2）或300 pfu的SC09（0.25LD50），其中的影响可以更清楚地观察到TCP（Shan et al。>，2017的图4C和4D）。对于WSN病毒的亚致死感染，所有动物组都可以存活至感染后至少第9天（图2），因此可以收集感染组织进行组织学分析（Shan e >的图5） t al。>，2017）。除了在第9天处死小鼠进行进一步分析外，该过程几乎与上述相同。

图2.使用低剂量的病毒来保证所有组的小鼠能够存活至感染后至少第9天。在第0天至第14天（A）的整个感染时间过程中监测小鼠的体重。小鼠的存活曲线显示在B.
中

数据分析

使用统计产品和服务解决方案（SPSS），使用Bliss算法计算半数致死剂量。使用GraphPad Prism分析存活曲线和重量变化曲线。数据由学生 t > -test分析。 P >值＆lt; 0.05被认为是统计学上显着的差异。 ns >， P >> 0.05; *， P >＆lt; 0.05; **， P >＆lt; 0.01; ***， P >＆lt; 0.001。使用GraphPad Prism进行统计分析。

食谱

1 mg / ml反式-2-苯基环丙胺盐酸盐TCP
将50毫克TCP溶于50毫升PBS中重新配制后，溶液应储存在4°C，避光
2.4％Avicel
将1.2克Avicel溶于50毫升18MΩH 2 O中重构后，将溶液高压灭菌，然后在4℃下储存
6％BSA
将0.6克BSA溶于100毫升PBS中重构后，将溶液用0.22μm过滤器过滤，然后储存在-20℃
叠加媒体
1x DMEM
1.2％（w / v）Avicel
0.3％（w / v）BSA

致谢

本研究得到了国家杰出青年学者自然科学基金（31525008）和B.L.的资助。和国家自然科学基金（81590766,81330072,81360250,31500714,31370863,81772202,31570171）;中国国家重点基础研究项目资助项目2014CB541803和2014CB541903;中国国家重点研究发展计划（2016YFC1200403）; “上海学术研究领袖计划”（16XD1403800）致B.L.和“新星人才计划”（15QA1404000）到K.X.来自上海市科学技术委员会。

利益争夺

作者宣称没有竞争利益存在。

伦理

动物实验经中国科学院上海巴斯德研究所机构动物护理和使用委员会批准（动物协议＃A2015006）。所有动物护理和使用方案均按照中华人民共和国国务院批准的“实验动物管理条例”进行。

参考

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