材料和试剂

50毫升带附帽的聚丙烯离心管（Boekel Scientific，目录号：120021）
带吸管盖的瓶子（见图1B和1C）（耐嚼，目录号：101445）
小鼠：成年（7周龄或更大）小鼠（C57BL / 6J）（THE JACKSON LABORATORY，目录号：000664）
注意：也可以使用小鼠的替代菌株和年龄。将小鼠单独饲养，各自置于其各自的笼中，在温度受控（约23℃）和湿度12-12小时光 - 暗循环的环境中，可自由获取食物。有关详细信息，请参阅Notes中的动物注意事项。>
100％酒精和稀释液：8％，16％和32％（Sigma-Aldrich，目录号：1012768）

图1.显示用于评估酒精偏好的实验装置的照片。 A.幼稚或条件性敲除小鼠和野生型对照受到急性应激的管。 B.管，水瓶和干净的空鼠笼。 C.对照笼的图像。 D.用于条件性位置偏好的装置的图像。

设备

鼠标聚碳酸酯家用笼（7.5 x W x 11 in L x 5 in H），带标准木片鼠标垫（Fisher Scientific，目录号：01-286-13A）
制造商：Tecniplast，目录号：1290D00SU。>
注意：在适应期间允许标准笼子更换（见下文）。但是，建议在数据收集期间避免更换笼子以防止泄漏。可以在阶段之间清洁笼子。每个主题鼠标一个笼子。>
不锈钢线笼盖改装，允许两瓶和食物的空间（Fisher Scientific，目录号：01-286-13A）
制造商：Tecniplast，目录号：1290D00SU。>
用小（1毫米）钻头钻孔（在50毫升聚丙烯离心管顶部制作三个小孔，让鼠标呼吸，并在盖子上插一个较大的孔以插入尾部）
Thermo Scientific称重秤（Thermo Fisher Scientific，目录号：20031）

软件

Activity Monitor软件（Med Associates，St。Albans，VT）（用于自动数据收集）
GraphPad PRISM 6.0软件（GraphPad Software.Inc。，San Diego，CA，USA）（用于数据分析）

程序

所有实验均在暗光阶段，在昏暗的光照下进行。

实验装置
1. 动物：使用NaïveC57B1/ 6Js，并作为DAT- Cnr2 >条件性敲除（cKO）小鼠的野生型对照。先前报道了cKO小鼠的产生和繁殖（Liu 等人，>，2017）。
2. 在受控的湿度和温度下，实验空间应安静且昏暗。
3. 所有笼子应放在指定用于该实验的架子上。机架应稳固，以避免移动并防止泄漏。在取出瓶子时，实验者应该小心，以尽量减少泄漏量。应避免泄漏，以减少不希望的变化。
4. 实验区域应清洁，所有测量应在一天的同一时间进行。
5. 其中一个笼子将是“控制笼”。除了鼠标之外，这个笼子将具有上述所有内容。
6. 所有笼子都应标有特定实验的信息，例如小鼠的品系，年龄和性别。食物应始终保持在右侧以保持一致性。
设置2瓶选择测试
1. 用150毫升水填充所有瓶子并放在吸管上。
  注意：通过翻转瓶子确保没有漏水。>
2. 用永久性标记中的主题鼠标（1,2,3 ......）标记每个瓶子。用相同的数字标记笼子。
3. 将2个瓶子放在电线盖上（图2），尽量少摇动以避免滴水。两个瓶子应放在分开的金属架的一侧，另一侧留下食物。将食物颗粒放在电线盖的另一侧。
  注意：确保食物始终在右侧，以保持一致。使小鼠适应于测试室，具有与菌落室相同的条件（22±2℃;湿度：55±5％; 12小时暗淡/人造光/ 12小时黑暗循环：在下午7点关灯）。 >
习惯于2瓶
1. 在受控条件下将一只小鼠放入适当的小鼠笼中（参见设备）（参见材料和试剂）。
2. 将受试者分离成单独的笼子，并给它们两个装有150ml水的瓶子。在这些条件下让小鼠适应环境至少4天。
为酒精偏好设置2瓶选择
1. 取下瓶子并清洁它们。
2. 将水与100％酒精混合至16％。
3. 对于每只小鼠，用150ml水填充一瓶，用酒精溶液填充另一瓶。将吸管盖放在瓶子上。
  注意：通过翻转瓶子确保没有漏水。>
4. 用指定数量的小鼠标记每个瓶子，用永久性标记物（例如>，1 H 2 O / 1 EtOH）标记水或酒精。
5. 记录瓶盖上的重量并记下记录表上的值。
评价酒精偏好
1. 将2个瓶子放在电线盖上，轻轻摇动以避免滴水。两个瓶子应放在分开的金属架的一侧，另一侧留下食物。将食物颗粒放在电线盖的另一侧。
  注意：确保食物始终位于右侧，以保持一致。>
2. 每天评估水和酒精溶液的消耗量，持续5天。记录重量。监测液体流动或溢出的任何问题，例如>，吸管下方的湿垫层。每天切换瓶子的位置（左侧与右侧）。
3. “控制笼”只有两瓶没有鼠标的水。称量这些瓶子以确定倒置瓶子时的溢出量，并稍后校正其他组的数据。
急性应激诱导的酒精偏好（5天）
1. 设置2瓶酒精选择（如上所述）。
2. 在第一天取出瓶子进行每日称重后，将小鼠随机分配到实验组或对照组。用“控制”或“实验”标记笼子（在鼠标编号所在的位置上方）并将它们按组放在架子上。将实验组的小鼠约束在50ml锥形管中1小时。之后，他们被释放，并为两组（控制和实验）的瓶子再次放入笼子。
3. 连续5天重复这些步骤。每天称量瓶子，并在每个阶段之前和之后称重小鼠。
4. 酒精偏好的一般时间表由5天内的程序D-F描述。＆nbsp;
慢性轻度压力（CMS）诱导饮酒（4-7周）（表1）
1. 在单独的房间中为实验组和对照组设置单独的野生型和选择的cKO小鼠组（每组n = 6）。除非应激对照组外，所有动物均单独圈养。
2. 对于CMS方案，按照半随机方案表1对小鼠施加各种应激物，按计划进行4-7周。
3. 每周的压力方案包括食物剥夺12小时，缺水12小时，潮湿的床上用品12小时，隔夜频闪照明，尾部悬浮10分钟，管约束30分钟，如上所述，大声的音乐过夜，金属丝网取代床上用品12小时，30分钟将入侵者鼠标引入笼中并关闭或打开灯。这些压力因素在早晨或过夜配对。
4. 独立房间内的所有非CMS组都随时获得食物和水。
条件性地方偏好（CPP）
使用Med Associates（St. Albans，VT，USA）的红外光束探测器开放式野外装置（ENV-510）进行酒精CPP训练和测试。
1. 使用来自Med Associates（St.Albans，VT，USA）的红外光子探测器开放式野外装置（ENV-510）进行酒精CPP训练和测试，该装置配备有两室位置偏好插入物（ENV-512），如如图1D所示。舱室1的地板具有平行杆（半径3毫米，中心间距8毫米），外面覆盖黑色纸板纸。隔室-2有一个不锈钢丝网（6 x 6）地板，白色纸板纸覆盖在墙壁外面。每个隔间为13厘米（宽）×15厘米（深）。
2. 在三个阶段（图3）（预处理，调节和后处理阶段）中执行每组中的所有调节步骤和偏好测试。
3. 在测试日的后调节阶段期间，允许小鼠探查两个隔室15分钟。
4. CPP评分定义为在酒精配对隔室中花费的时间减去在CPP测试期间在盐水配对隔室中花费的时间。
  
  图2.设置2瓶选择酒精偏好和水可用
  
  图3.使用的CPP范例的图形表示。所有调理会话和偏好测试每天在同一时间进行。在调节阶段之前使动物在CPP装置中适应45分钟。
表1.慢性轻度压力因素（4-7周）＆nbsp;

数据分析

所有数据都在电子表格中转录。为原始重量数据设置一列，并在其旁边显示已更正的重量数据列。校正后的重量数据是每天从对照笼中溢出（水和酒精）的量。该数字将从原始重量数据中减去。每天，必须从原水和酒精重量数据中减去溢出量，以确定校正后的重量。
＆NBSP;为了计算每天消耗的酒精或水的量，每天平均瓶重。然后从当天每组的瓶重的平均值中减去这些值。从前一天减去新的瓶子重量，给小鼠一夜之间饮用的酒精或水量。
＆NBSP;第0天是瓶子最初装满150毫升水/酒精，因此当天的消耗量是0.
＆NBSP;酒精偏好率是通过将消耗的酒精量除以消耗的总液体（酒精+水）来确定的。
＆NBSP;活动监视器使用光电断束计数记录在每个隔室中花费的时间。记录每只小鼠在隔室中花费的时间，并将CPP得分定义为在配对的隔室中花费的时间减去在CPP测试期间在盐水配对隔室中花费的时间。活动监控软件（Med Associates，St。Albans，VT）用于自动数据收集。

代表性数据：图4是酒精偏好测试的代表性数据。在该试验中，将小鼠单独饲养并用两个可用于三天的流体瓶进行习惯。我们使用两组：12只雄性C57 / 6J小鼠作为野生型和12只雄性DAT- Cnr2 >条件性敲除（cKO）小鼠，它们在中脑多巴胺神经元中不表达CB2R。在实验当天，将所有动物称重。一瓶装满150毫升自来水，另一瓶装150毫升16％乙醇溶液。将它们与顶部称重并放置在笼子顶部（正确标记）。对于酒精偏好测试，在上午10点对每只动物称重瓶子连续五天。不同笼子中瓶子的位置随机放置在笼子的哪一侧。在实验的第二部分，然后将每组分成两组。一组（n = 6）通过将它们放入50ml管中每天1小时而连续5天受到压力。剩下的动物留在笼子里。每个动物的所有瓶子同时连续五天称重，并且所有瓶子在上午11点放置在笼子的顶部。在所有实验中，计算消耗的醇与水的比率和总流体消耗量以获得优选比率。通过将消耗的总液体（酒精+水）消耗的酒精量除以亚急性应激来确定酒精偏好比。野生型小鼠优选在水上的醇，通过显着增加（通过重复测量ANOVA测定）显而易见。 DAT- Cnr2 > cKO小鼠（小鼠未显示酒精-CPP诱导，图5），并且未显示对酒精偏好的显着增加（图4）。在用急性应激进行的5天试验期间，野生型小鼠比DAT- Cnr2 >小鼠更喜欢酒精（通过Student's t > - 基因型之间的比较测定）。这些结果表明，即使在急性应激条件下，DAT- Cnr2 > KO小鼠也能抵抗酒精消耗。这支持了先前的报道，CB2受体激动剂参与了应激但不应用于非应激对照小鼠的酒精偏好的发展和增强（Ishiguro et al。>，2007; Onaivi et al 。>，2008）。

图4.野生型小鼠（白色圆圈）和DAT- Cnr2 >在正常条件下（A）和响应急性应激方案（B）对酒精对水的偏好比cKO小鼠（黑眼圈）连续5天。数据表示为5天内平均值（SEM）每日消耗比的平均值±标准误差。 t > - 测试的基因型之间存在显着差异（* P > <0.05，** P > <0.01，*** P >＆lt; 0.001）。

图5.删除多巴胺神经元（DAT- Cnr2 > cKO）小鼠和酒精偏好中的CB2R。 8％酒精诱导的CPP（ P >＆lt; ; 0.05）在野生型小鼠中，但DAT- Cnr2 > cKO小鼠在酒精和盐水之间的调理后阶段没有显示出显着差异。

笔记

动物考虑：

重要的是进行初步研究以表征特定设备，环境和动物的行为表型。我们测量了DAT- Cre >和DAT- Cnr2 >小鼠同窝小鼠的野生型，杂合子和纯合子的基线行为，以避免遗传混淆。对于不同的近交或远交的小鼠品系，或者如果在酒精偏好测试之前对小鼠进行手术或行为操作，尤其如此。
如果需要，可以通过称量装有150ml水的瓶子并称重顶部并放置在笼子顶部三天来确定消耗基线。

致谢

该协议是为了纪念我们的共同作者Norman Schanz，他的突然和悲剧性的损失将很难在动物实验室取代。这项研究得到了威廉帕特森大学的支持。 ACA得到了墨西哥国家科学技术委员会的支持（CONACYT＃CVU332502 / 232728）。 HI得到公共利益信托研究援助基金的应激相关疾病（纪念今井基米），KAKENHI（18023009,20023006和20390098）的支持。 ESO得到NIH资助DA032890的支持。 QRL由IRP / NIA / NIH支持。我们感谢威廉帕特森大学科学与健康学院的院长Venkat Sharma博士，感谢学生们在动物实验室维护我们的老鼠。我们还感谢Sneha Tammareddy，Eugene Dennis，Branden Sanabria，Paola Velandia，Steve Gross和Monika Chung的技术助理，他们在ESO实验室工作。该协议和数据改编自我们以前的工作（Liu et al。>，2017）。

利益争夺

作者没有利益冲突申报。

伦理

实验程序遵循实验动物护理和使用指南，并由William Paterson大学动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

参考

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