材料和试剂

气动设备
1. 适配器Luers（Cole-Parmer，目录号：EW-30800-06和EW-30800-24）
2. 1 L Kitasato烧瓶（Prolab，目录号：PL287）
3. 硅胶管（3 mm内径和5.2 mm外径，4.9 mm内径和9.7 mm外径，更大或更小尺寸取决于样品直径，优先选择厚壁管，因为它们在夹紧后密封性更好）
4. 刚性管（Cole-Parmer，目录号：EW-30600-62）
5. 真空源，注射器或真空泵（Prolab，目录号分别为032357和VAC29-110）
6. 三通旋塞（Cole-Parmer，目录号：EW-30600-07）
7. 真空容器（具有刚性壁的容器或管以存储真空; 1-10ml体积通常就足够了）
8. 建议使用30至110 kPa的真空计（霍尼韦尔，目录号：142PC05D或26PCCFA6D或MPX5100AP;恩智浦半导体;荷兰.Farnell，目录号：1386589,731766和1457156）
样品制备和处理
1. 塑胶
2. 塑料石蜡膜（Prolab，目录号：PM996）
3. 塑料夹（Cole-Parmer，目录号：RZ-06832-02）和/或拉链

设备

电压表
1. 钳
2. 锋利的剃须刀
3. 电压表或电压记录仪（142PC05D或MPX5100AP精度为1 mV，26PCCFA6D精度为0.01 mV）
4. 替代方案：用于Arduino UNO微控制器板（Plant Technology and Environmental Monitoring-PLANTEM）的气动屏蔽，与26PCCFA6D一起使用（详见图4）
木质部水势测量
1. 压力室（PMS仪器，型号：PMS 1000，或其他）
2. 笔记本和USB数码显微镜（Jiusion，或其他）
  注意：由于安全问题，我们不鼓励使用放大镜。>

程序

气动测量需要构造气动装置并测量空气排放和木质部水势。每个步骤在下面和视频1中描述。

视频1.使用电压表演示气动设备组合和空气放电测量程序

气动仪器（图1）
气动装置基本上由一个装有真空的容器连接，一个用于读取真空压力的仪表和一个用于填充储液器的真空源。

图1.气动设备。：一种。真空设备。 a）用作真空源的普通注射器; b）刚性管也用作真空容器; c）真空计（142PC05D）耦合到12V电源和电压调节器; d）电压表探头连接到传感器输出。 B.分支连接细节。 e）用塑料夹紧住弹性管到样品; f）塑料薄膜（必要时涂胶）以避免泄漏; g）弹性管在被塑料夹压紧时变形。 C.真空源的替代设置。真空泵用于在真空储存器中储存真空（h;在该实施例中为1L Kitasato烧瓶）。真空储存器用于通过第三个三通旋塞（i）向真空容器施加真空。 S1和S2分别是三通旋塞阀1和。
1. 将真空容器连接到第一个三通旋塞（S1）。将硅胶管（足以使分支杆紧固）连接到S1的一个出口，并将S1的另一个出口连接到大气（图1A和1B）。
2. 将真空容器连接到第二个三通旋塞（S2）。将真空计连接到S2的一个出口，将真空源连接到S2的另一个出口（图1A）。
  1. 选择真空容器容积（V r ; L），以确保真空计的足够精确度。必须从管道和旋塞阀数据表（每个刚性管[Cole-Parmer，USA]具有1.304 ml）测量或计算V r 。几毫升的真空容器通常就足够了（单独的设备的管道可能足以作为真空容器）。
  2. 真空源可以是注射器或真空泵。可以将大量真空储存在容器（例如Kitasato烧瓶）中，并用于补充设备真空容器以便于使用（图1C）。
  3. 可以读取真空计：用电压表;电压记录器连接到计算机;或者使用Pneumatic Shield和Arduino UNO微控制器。
  4. 除连接分支的管道外，所有管道必须是刚性的，以避免真空下的体积变化。将分支连接到S1的管应该是弹性的，因此分支可以紧密连接。我们建议使用鲁尔锁连接，以方便使用并防止泄漏。
空气排放测量（图2）
从分支（AD）排出的空气是离开分支到真空容器的空气量。测量真空容器中的空气压力变化并使用理想气体定律将其转换成体积。 AD随着测量的分支节段的栓子量而增加，直到分支完全栓塞。必须使用不同木质部水势中的相同样品测量多个AD点，以便数据可以标准化，并且可以在下一部分估计栓塞阻力曲线。

图2.空气流量曲线测量。构建和排气曲线的步骤。 1）用真空填充真空容器。 2）测量初始压力。 3）对样品施加压力，等待2.5分钟并测量最终压力。 4）测量样本水势。 5）让样品干燥。进一步干燥后重复第一步。
1. 选择一个完全水合和非栓塞的分支段与一些叶子。
2. 用锋利的剃刀从植物上切下树枝。
3. 使用塑料夹/塑料薄膜将分支连接到S1中的弹性管，以确保无泄漏或无明显泄漏。＆nbsp;
4. 在S1中将分支打开到大气，并将分支关闭到S2中的真空容器（图2.1）。
5. 使用真空源将真空容器压力降低至35-40 kPa（大气压减去55-60 kPa），并将真空容器关闭到S2中的真空源（图2.1）。
6. 读取真空容器的初始压力（P i ; kPa）（图2.2）。
7. 在S1中将分支段关闭到大气，并将其连接到S2中的真空容器（图2.3）。
8. 2.5分钟后，读取真空容器的最终压力（P f ;图2.3）。
9. 使用理想气体定律计算从分支排出的空气摩尔数Δn（摩尔）：
  
  （1）Δn= PiVr / RT - PfVr / RT;
  
  其中R是气体常数（8.314 kPa L mol -1 k -1 ）; T是测量期间的设备/室温（K），V r 是储层体积（L）。
10. （可选）使用理想气体定律将排出的空气摩尔数转换为在大气压（AD;μl）下排出的空气量：
  
  （2）AD =（ΔnRT/ P atm ）x 10 6
  
  其中P atm 是大气压（kPa），10 6 是从L变为μl。
11. 测量分支样品的木质部水势（Ψ x ）并用胶水密封叶片（图2.4）。关于样品处理和叶片和木质部水势平衡问题，请参见“注11”。
12. 让支管在工作台上干燥（图2.5）。
13. 将样品的叶水势包装起来，用Ψ x 平衡。
14. 从步骤B5再次开始以获得另一个数据点。分支样本的最后一个数据点应该是完全栓塞的数据点，因为所有数据都将由最后一个点标准化。
注意：>
1. 每当没有进行测量时，必须将分支连接到大气，以确保分支内的初始气压是大气压。在AD测量之后，将分支连接到大气至少2.5分钟，然后再进行另一项测量，以确保分支内没有真空。>
2. 分支在脱水时可能会收缩，与S1的连接可能会松动。拧紧连接以确保无泄漏。>

数据分析

数据处理需要使用气动测量来估计电导率（PLC）的百分比损失。 PLC与分支样品的最大空气排放百分比（PAD）成比例。使用基础软件包（R Core Team，2011 [版本2.1.2]）进行数据处理和分析的示例电子表格和R脚本在附录中提供（“ data.example.xls ”和“ data.analysis.r ”）。要获得PAD，必须对每个分支样本标准化AD（见图3A和3B）。

图3.空气排放和百分比空气排放曲线。 A.不同木质部水势（Ψ x ）中分支样品的空气排放测量示例。 B.来自（A）的空气排放措施通过最大空气排放标准化，以获得作为Ψ x 的函数的最大空气排放百分比（PAD）。红线是PAD数据的回归。蓝线是用液压方法获得的电导率（PLC;点未显示）曲线的百分比损失。不同的符号表示气动方法中来自不同样品的数据。树枝在零下3.5-4.5 MPa左右失去了叶子。

的 Data.example.xlsx。用于写入数据和计算AD和PAD的示例电子表格。
Data.analysis.docx。 R脚本，包含用于处理和分析使用气动方法收集的数据的例程。

图4.气动设备护罩。 A.由PLANTEM开发的Arduino UNO气动护罩模型。 B. Pneumatic Shield原型自动记录两个真空计（26PCCFA6D）。在此示例中，正在测量左分支（由蓝色LED指示），同时数据显示在LCD显示屏中并记录到SD卡。当按下与每个真空计相关联的按钮时，测量开始，并且每秒记录数据。

旋塞阀内部也有空隙。如果对于一次测量，您将一个方向关闭活塞而另一个方向使用不同的方向，则总空气量可能略有不同。

泄漏：如果泄漏很严重，可以计算并从每次测量中减去泄漏。

传感器电压供应：可以使用简单的电压调节器为真空计供电。我们建议使用LM78XX电压调节器（通常为LM7810或7812）进一步控制传感器输入电压，因为输入电压中的噪声会改变电压表输出。使用较低输出电压26PCCFA6D传感器时，这一点尤为重要。 LM78XX电路和组装好的传感器（142PC05D）如下图5所示：

图5.压力传感器和简单的电压调节器。 A. LM7810电压调节器设置。 B和C. C）中使用的电路板。 B）中的电路是在原始印刷电路板上使用永久性标记手工绘制的，并用高氯酸铁腐蚀。为部件制造孔，然后将它们焊接在板上。 7810是LM7810稳压器。 C1和C2是电解电容，用于滤除噪声并减少输入电压的瞬态变化。

真空计具有非常低的功耗。它可以在现场或偏远地区使用12 V汽车电池供电数天。在这种情况下，电压调节器是基础。

AD测量值可以用空气的摩尔数或大气压下的等效体积表示。我们建议将体积表达为与解剖学测量和设备描述相同的单位。

我们使用PAD代替AD来估计栓塞，因为相同物种的样品之间的可变性可能很大。如果对样本有足够的控制，因此变异性很小或整个曲线由一个分支样本组成，AD可以直接用于估计栓塞。

我们使用2.5分钟的放电时间，因为我们发现它足以确保精度。可以使用更短或更长的时间。 AD在时间上不是线性的，因此在比较不同时间与相同物种/样品时应该小心。如果要测量样品中的所有空气体积，可以使用较长的放电时间或将放电曲线外推至无穷大，找出平衡时的压力并使用它来计算样品内的总空气空间。

可以从S1移除分支连接（图1B），而无需从弹性管中取出样品，以便于处理多个样品。例如，如果您在同一天测量10个样品，请使用10个单独的连接（鲁尔锁，弹性管，塑料夹和样品设置），并将每次要测量的样品连接到S1。

通过被测分支段的最大AD（ADmax）标准化每个AD测量（AD i ;其中i代表每个单独的测量）：

（3）PAD = 100 x（AD i / AD max ）;

其中PAD是从样品中排出的最大空气百分比，与PLC有关。
对于某些物种，即使在完全水合并且没有栓塞存在的情况下，AD也可能是重要的，可能是由于木质部中的自然空气空间。在这种情况下，必须从每个AD测量值中减去初始AD（AD ini ），以便PAD与PLC相关：

（4）PAD = 100 x（AD i - AD ini ）/（AD max - AD ini ）
栓塞曲线的构建遵循用于计算PLC曲线的标准方法（拟合S形曲线，指数曲线，等>），但使用PAD和Ψ x 之间的关系估计PLC曲线。质量曲线必须在PAD变化很小的高水势，过渡区和PAD停止变化的第二个平台处呈现平台（图3B）。

笔记

我们建议使用由Plant Technology and Environmental Monitoring（PLANTEM，巴西，图4）开发的Arduino UNO微控制器的Pneumatic Shield，因为它允许同时测量两个样品，无需手动记录真空计电压，有效地使测量速度加倍。

4660/5000 许多植物物种在树皮/木质部中产生树脂或乳胶。树脂/乳胶的分泌会堵塞容器并改变空气排放。我们建议验证每种研究中是否发生这种情况。如果发生这种情况，用锋利的剃刀切割分支，等待1小时，同时将样品装袋以停止树脂/乳胶分泌，并在连接到装置之前再次切割茎干通常可以解决问题。
为了确保木质部和叶片水势平衡，叶水势可以用作木质部水势的指标，在测量叶片水势之前，样品必须在塑料袋外保持尽可能少的时间。最好的方法是在装袋样品时测量空气排放，然后取出袋子测量水势。
样品连接（图1B）可以容纳大量的空气，可以使AD测量值膨胀。我们发现这可以通过折扣测量的第一秒来纠正。折扣测量的第一秒会导致对工厂内部总空气的低估，但这对估计PAD值没有影响，因为它们是相对的。在不折扣第一秒的情况下测量AD的替代方案是从总空气排放中减去样品连接体积。排出的空气总量（Δn），以摩尔计，然后可以计算为：

Δn=（n r + n sc ） - n f

其中n r 和n sc 分别是储液器和样品连接器内的初始空气量，其与测量前设备中的空气总量相加。 n f 是设备中的最终空气量。由于n sc 在测量前处于大气压力下，上述等式[在这种情况下等式（1）]变为：

Δn=（P i V r / RT + P atm V sc / RT） - P f V r / RT
其中V sc 是样本连接的体积。所有其他程序都是平等的。
协议中使用的单位，术语和定义：
AD - 从分支段（μl）排出的空气
AD max - 从分支段（μl）排出的最大空气量。当它完全空化时，它是样品的AD AD ini - 完全再水化且无气蚀（μl）时排出的空气
P i - 真空容器的初始压力（kPa）
P f - 真空容器的最终压力（kPa）
P atm - 大气压（海平面约101.3 kPa）
PAD - 从分支排出的最大空气百分比
PLC-木质部水力传导百分比损失
S1 - 将分支段连接到真空容器和大气的三通旋塞 S2 - 三通旋塞将真空容器连接到真空源和真空计
R - 气体常数（8.314 kPa L mol -1 k -1 ）
T - 仪器/室温（K）
V r - 真空容积（L）
Δn-真空容器中摩尔数的变化（ni减去nf; mol）
Ψ x - 木质部水势（MPA）

致谢

该研究由FAPESP /微软研究（授予11 / 52072-0）资助，授予R.O.我们感谢UNICAMP生态学和植物生物学研究生课程以及高等教育协调机构（CAPES）奖学金给P.R.L.B.我们感谢资助P.R.L.B.的牛顿国际奖学金（资助NF170370）。在本手稿和圣保罗研究基金会的最终撰写中，授予L.P.（FAPESP，Grant No. 2017 / 14075-3）奖学金。我们感谢David Bartholomew审阅和校对手稿。

利益争夺

作者声明他们没有利益冲突。

参考

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