材料和试剂

0.1-10μl移液器吸头（Thermo Fisher Scientific，QSP，目录号：104-Q）
1-200μl移液器吸头（Thermo Fisher Scientific，QSP，目录号：110-B-Q）
1-1,000μl移液器吸头（Corning，Axygen ®，目录号：T-1000-B）
1.5毫升微量离心管
牙签（银沙，目录号：918）
网格（Emcn，目录号：AZH75HH）
40孔平面嵌入模具（Emcn，目录号：DZ10590-40）
4周龄的 Nicotiana benthamiana >植物
农杆菌菌株GV3010
E-64d（Sigma-Aldrich，目录号：E8640-1MG）
多聚甲醛（Electron Microscopy Sciences，目录号：157-8）
戊二醛（Structure Probe，SPI-CHEM，目录号：02607-BA）
磷酸二氢钠脱水（NaH 2 PO 4 •2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：1.06342.1000）
磷酸氢二钠十二水合物（Na 2 HPO 4 •12H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：04273）
六氰基铁酸钾（K 3 [Fe（CN） 6 ]）（Sigma-Aldrich，目录号：702587）
OsO 4 （Ted Pella，目录号：18451）
双蒸<子> 2 O＆NBSP;
醋酸铀酰（DEUTSCHL和LUXEMBURGPRODUZIER TSPE ZIA LCHEMIKALIEN PROD UKTION）
醋酸铅（结构探针，SPI-CHEM，1161108）
乙醇（国药化学试剂，目录号：10009218）
环氧丙烷（国药化学试剂，目录号：80059118）
在ddH 2 O中1％（w / v）乙酸铀酰和在ddH 2 O中2％（w / v）乙酸铀酰
DDSA（结构探针，SPI-CHEM，目录号：02827-AF）
SPI-PON TM 812（结构探针，SPI-CHEM，目录号：02659-AB）
NMA（结构探针，SPI-CHEM，目录号：02828-AF）
DMP-30（结构探针，SPI-CHEM，目录号：02823-DA）
HCl（国药化学试剂，目录号：10011008）
NaOH（国药化学试剂，目录号：10019762）
Trizol试剂（天根）
无RNase的DNA酶I（Sigma-Aldrich）
寡（dT）
TRANScript莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（天根）
Power SYBRGreen PCR master mix（Applied Biosystems）
多聚甲醛 - 戊二醛固定液（2％/ 2.5％），pH 7.2（见食谱）
0.1 M磷酸盐缓冲液（PB），pH 7.2（参见配方）
OsO 4 - hexacyanoferrate固定液（见食谱）
1％（w / v）醋酸铀酰（见食谱）
2％（w / v）醋酸铀酰（见食谱）
0.2％醋酸铅（见食谱）
Epon 812（见食谱）
20μME-64d（见食谱）

设备

净水系统（Merck，Milli-Q ®，型号：Advantage A10）
美工刀（FLYING EAGLE，目录号：74-S）
Pincette（北京XXBR科技，产品目录号：T5889）
钻石刀（DiATOME，目录号：DU4535）
Eppendorf Research ®加移液管0.5-10μl
Eppendorf研究®加移液管10-200μl
Eppendorf Research ®加移液管100-1,000μl
隔膜真空泵（天津金腾实验设备，目录号：GM-0.50II）
摇动培养箱（Miulab，目录号：ES-60）
电子天平（Sartorius AG）
电加热定温中耕机（天津泰斯仪器，型号：DH4000BII）
电热恒温干燥箱（天津泰斯特仪器，型号：202-0AB）
Ultramicrotome（徕卡显微系统，型号：EM UC6）
睫毛笔
染色机（Leica Microsystems，型号：EM AC20）
电子显微镜（Hitachi High-Technologies，型号：H-7650）
Bio-Rad CFX96实时PCR检测系统

程序

Nicotiana bentiamiana >植物在25℃，16小时光照/ 8小时黑暗循环的生长室中生长4周。
将含有pTRV1和pTRV2或其衍生物 GAPCs >或 GAPCs / ATG3 >共沉默构建体的农杆菌菌株GV3010以1：1的比例混合并渗入前两叶中。植物分别在植物中沉默 GAPCs >和 GAPCs / ATG3 >。
当靶基因在浸润后16-18天成功沉默（dpi）时，将20μME-64d渗入前两个新叶中，其中基因成功沉默。
用E-64d处理8-12小时后，将处理过的叶子切成小块（1mm×1mm）。将小片叶子固定在1.5ml管中的300μl多聚甲醛 - 戊二醛固定溶液（2％/ 2.5％，pH7.2）中。使用隔膜真空泵在0.1MPa下将它们抽真空10-30分钟，直到碎片沉到管的底部。用牙签戳这些碎片，帮助它们沉入管底。用多聚甲醛 - 戊二醛固定液（2％/ 2.5％，pH7.2）在冰上固定这些碎片1小时。
用振荡器中的0.1M PBS缓冲液洗涤碎片3次，每次15分钟（步骤5至10应在振荡器中实现）。
用OsO 4 - 六氰合铁酸盐固定液（1％/ 1.5％）在冰上固定样品1小时。
在室温（RT）下用0.1M PBS缓冲液洗涤碎片3次，每次15分钟。
在室温下用ddH 2 O洗涤碎片3次，每次10分钟。
在室温下用1％乙酸双氧铀在室温下染色样品1小时。
在室温下用ddH 2 O洗涤碎片3次，每次15分钟。
将样品在30％，50％，70％，80％，90％和95％（v / v）的分级系列乙醇中脱水，每次10分钟。
在100％乙醇中脱水3次，每次10分钟。
用100％环氧丙烷将样品脱水2次，每次10分钟。
将样品与环氧丙烷：epon 812以2：1的体积比例在振荡器中在室温下孵育30分钟。
将样品与环氧丙烷：epon 812以2：1的体积比例在振荡器中在室温下孵育30分钟。
将样品与epon 812在振荡器中孵育过夜。
刷新epon 812 3次，每次3小时。
将样品嵌入40孔扁平嵌入模具中，使用epon 812。
用epon 812在37℃下渗透样品4小时。
在60℃下聚集树脂，24-48小时。
用艺术刀切割嵌入块直到可以锯切样品。继续用玻璃刀切割样品，直到表面光滑。
用艺术刀切割梯形样品表面。
使用金刚石刀将嵌入块切割成超薄切片机上的70-nm超薄切片。
用Formlash涂层网格上的睫毛笔收集它们。
用2％乙酸双氧铀染色切片30分钟，用0.2％乙酸铅染色5分钟，用染色机染色。
在电子显微镜下检查切片。
观察叶肉细胞中的自噬结构，记录自噬结构的数量和细胞数量。

数据分析

如图1所示，在 GAPCs > -RNAi叶片的叶肉细胞液泡中观察到大量单膜自噬体的超微结构（箭头），而在对照中观察到的自噬体数量很少。或 GAPCs / ATG3 > -RNAi叶。病毒诱导的基因沉默（VIGS）在此用于沉默 GAPC >和 ATG3 >。在图1B中，在 GAPC > - 沉默的植物的细胞质中观察到规范的双膜自噬体（箭头）。黑色箭头显示液泡内的自噬体。图1C显示了三个样品的相对自噬活性。通过将全食欲结构（自噬体和自噬体）的数量除以叶肉细胞的数量来计算自噬活性。将TRV对照的自噬活性标准化并设定为1.0。来自2-3个不同包埋块的大约20个细胞用于量化每个处理中的自噬结构。统计分析表明，与对照和 GAPCs / ATG3 > - 沉默叶片相比， GAPCs > - 沉默植物的自噬活性显着增加，表明 GAPCs的沉默>激活自噬，激活的自噬依赖于ATG3。

图1.在对照和VIGS植物中通过TEM检测自噬样结构。 A.来自 GAPCs > - 沉默， GAPCs / ATG3的叶肉细胞的代表性TEM图像> -silenced和control leaves。在 GAPCs > - 沉默植物的叶肉细胞的液泡中观察到自噬体的超微结构（箭头）。 Cp，叶绿体; V，液泡。比例尺=1μm。 B.在叶肉细胞的细胞质中观察到的自噬体（箭头）和自噬体（箭头）的代表性超微结构。比例尺= 500nm。 C. GAPCs > - 沉默和 GAPCs / ATG3 > - 沉默植物中的相对自噬活性。 TRV对照植物中的自噬活性设定为1.0。值代表来自3个独立实验的平均值±SE。不同的字母表示显着差异（ANOVA， P > <0.05）。

笔记

由于植物自噬是一个快速过程，因此抑制自噬过程有助于观察瞬时中间体（Yoshimoto，2012）。 E-64d是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，可以预防自噬性空泡降解，从而增加自噬结构的数量（Liu et al。>，2005; Xu et al。>，2017 ）。 E-64d的渗透是可选的。这取决于实验的目的。
在制备TEM样品期间，应将空气湿度控制在低水平（<40％）。
应将样品快速加入多聚甲醛 - 戊二醛固定液中。
在应用多聚甲醛 - 戊二醛固定溶液，OsO 4 - 六氰合铁酸盐固定液和乙酸双氧铀溶液后，应彻底洗涤样品。
应彻底进行酒精脱水和树脂渗透。
除了细胞质中的其他双膜细胞器和囊泡之外，正确识别自噬结构至关重要。注意结构的膜结构，尺寸和含有物质。在 Nicotiana benthamiana >中，自噬体和自噬体为0.5-1.5μm结构。自噬体是双膜结构，而自噬体与液泡融合，因此变成称为自噬体的单膜结构。一个明显的特征是，自噬体和自噬体都含有自噬降解的底物，如蛋白质，细胞器，靶向脂质，碳水化合物，核酸和入侵病原体（Rabinowitz和White，2010）。
VIGS用于沉默 Nicotiana benthamiana >（Liu et al。>，2002）中的基因，并通过用重组体感染本氏烟草>来抑制基因表达。携带宿主衍生序列的病毒载体。
实时RT PCR用于确认靶基因的VIGS效率。
1. 使用来自叶子样品的Trizol试剂（Tiangen）提取总RNA。用不含RNase的DNase I（Sigma-Aldrich）处理样品以去除潜在的DNA污染。使用oligo（dT）引物和TRANScript moloney鼠白血病病毒逆转录酶按照制造商手册（Tiangen）逆转录RNA。＆nbsp;
2. 基因表达分析。使用Power SYBR Green PCR master mix（Applied Biosystems）在Bio-Rad CFX96实时PCR检测系统上进行实时PCR。将实时PCR循环设置为39.使用肌动蛋白基因作为内部对照（数据未显示）。

食谱

注意：除非另有说明，否则所有溶液均使用ddH 2 O制备。>

多聚甲醛 - 戊二醛固定液
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>组件
专注
多聚甲醛
2％
戊二醛
2.5％
0.1 M磷酸盐缓冲液
将pH调节至7.2（使用HCl）
0.1 M磷酸盐缓冲液（PB），pH 7.2
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>组件
专注
NaH _{2 PO _{4 •2H _{2 O
0.028 M
Na _{2 HPO _{4 •12H _{2 O
0.072米用NaOH调节pH至7.2}}}}}}
OsO 4 - hexacyanoferrate固定液
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>组件
专注
OsO _{4
1％（w / v）
六氰基铁酸钾
1.5％（w / v）}
1％（w / v）乙酸双氧铀
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>组件
专注
醋酸铀酰
1％
2％（w / v）乙酸双氧铀
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>组件
专注
醋酸铀酰
2％
0.2％醋酸铅
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>组件
专注
醋酸铅
0.2％
NaOH
4％
Epon 812（100 ml）
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>组件
内容
DDSA
16毫升
SPI-PON ^{TM 812
50毫升
NMA
35.6毫升
DMP-30
2毫升}
20μME-64d
1. 将E-64d在乙醇中稀释至10mM储备溶液并储存在-20℃
2. 在ddH 2 O中稀释10 mM E-64d至终浓度为20μM

致谢

该协议改编自SJ Han et al。>的工作（Han et al。>，2015）。这项工作得到了中国国家转基因项目（2016ZX08009-003-001）的支持。

利益争夺

作者声明没有利益冲突。

参考

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