第一部分：Caspase-3活性检测

Caspase-3活性测定是荧光测定，其使用荧光底物乙酰基Asp-Glu-Val-Asp 7-酰氨基-4-甲基香豆素（Ac-DEVD-AMC）检测细胞裂解物中Caspase-3的活性。它基于Caspase-3对Ac-DEVD-AMC的水解，导致荧光7-氨基-4-甲基香豆素（AMC）的释放。可以使用发光分光光度计检测AMC，其中激发波长为380nm，发射波长为420nm至460nm。底物的裂解仅发生在存在Caspase-3的裂解物中，Caspase-3是凋亡所需的基因;因此，产生的AMC的量与样品中凋亡细胞的数量成比例。

材料和试剂

培养皿（VWR，目录号：391-0439）
幻灯片（VWR，目录号：631-1551）
剃刀刀片（MARTOR，目录号：NO.743）
Eppendorf管（VWR，Eppendorf，目录号：700-5239）＆nbsp;
15毫升猎鹰（LF Equipamentos，目录号：166）
分光光度法比色皿（VWR，目录号：634-0677BTU）
96孔板（VWR，Corning，目录号：734-1664）
MilliQ水
冰
Micro BCA蛋白质分析试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Pierce TM ，目录号：23235）
Tris-HCl，pH 8（Sigma-Aldrich，目录号：93362）
EDTA，pH 8（Sigma-Aldrich，目录号：1233508）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100）＆nbsp;
HEPES pH 7.5（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）＆nbsp;
甘油10％（西格玛奥德里奇，目录号：G5516）
DTT（Sigma-Aldrich，目录号：646563）
Caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK（默克，目录号：264155）
Caspase-3底物Ac-DEVD-AMC（BD Biosciences，Pharmingen TM ，目录号：556449）
裂解缓冲液（见食谱）
分析缓冲液（见食谱）

设备

烤箱
发光分光光度计
移液器
涡流
离心分离机
平台振动筛
4°C冰箱
-20°C冰柜
37°C培养箱

程序

蛋白质提取（图2A）
1. 准备裂解缓冲液（见配方1）
2. 在带有冰的培养皿中，放置载玻片并将涡虫转移到载玻片上。用剃刀刀片去除多余的水并将涡虫切成小块（必要时用一张纸去除剃刀刀片上的粘液）。
  注意：至少5个涡虫，每个条件3-5毫米。
3. 每个涡虫添加100μl裂解缓冲液至载玻片，并用它将涡虫碎片吸入Eppendorf管中。把它放在冰上。＆nbsp;
4. 通过用P200移液并涡旋5秒进行均质化，尽可能将Eppendorf管保持在冰上。
5. 在4℃下以13,000 x g 离心10分钟。
6. 将上清液部分转移至4℃的新管中。长期储存保存在-20°C。
使用Micro BCA Protein Assay Kit测定蛋白质浓度（图2B）
1. 按照制造商的建议，进行必要的BSA蛋白稀释，以获得标准曲线。
2. 按照制造商的建议准备工作试剂。
3. 将样品稀释250倍（例如，2μl样品+498μlMilliQ水）。
4. 向每个分光光度计比色皿中加入500μl工作试剂+500μl稀释样品。还应对用于获得标准曲线的样品进行该程序。
5. 将分光光度计比色皿在60℃的烘箱中孵育1小时。＆nbsp;
6. 从烘箱中取出样品，用分光光度计测量吸光度（λ= 562 nm）。
  注意：所有样品应在不超过10分钟的时间内读取。
7. 使用步骤B1中进行的蛋白质稀释的值构建标准曲线。减去空白样品的值（没有蛋白质，在步骤B1中获得）以避免背景测量。计算样品的蛋白质浓度。将稀释因子的值乘以。
Caspase-3活性测量（图2C）
1. 准备化验缓冲液（见配方2）
2. 装入96孔板。＆nbsp;
3. 从空白井开始。空白溶液由125μl测定缓冲液+25μl裂解缓冲液组成。空白井必须一式三份完成。
  注意：96孔板中加载的所有样品必须一式三份。这意味着对于每个条件（空白，阴性对照和样品），您必须至少有三个孔。
4. 加载实验阴性对照。对于阴性对照，应使用来自对照样品的蛋白质。在每个孔中加载123μl测定缓冲液+20μg蛋白质（xμl蛋白质提取物+yμl裂解缓冲液直至25μl体积）+1.5μlCaspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK。阴性对照必须一式三份。
  注意：实验控制用于确认您正在测量Caspase-3活性。使用Caspase-3抑制剂被认为可以获得低水平的Caspase-3活性。必须有一个控件，但可以包含所需数量的控件。
5. 在剩余的孔中加载123μl测定缓冲液+20μg蛋白质（xμl蛋白质提取物+yμl裂解缓冲液至25μl终体积）。所有样品必须一式三份进行。
6. 将板在黑暗中于37℃孵育15分钟，同时搅拌。
7. 将2μlCaspase-3底物Ac-DEVD-AMC加载到所有平板孔中，并在黑暗中于37℃孵育2小时。
8. 使用发光分光光度计（激发380nm，发射440nm）通过发光测量酶活性。
图2. Caspase-3检测方案的一般视图。 A.卡通示例蛋白质提取。 B.蛋白质浓度测定的逐步进行。 C.如何装载板孔的例子。

数据分析

平均三次技术重复以获得每个样品的单次读数。
减去空白样本的值以避免背景读取。
绘制阴性对照，实验对照和目标样品。

第二部分：TUNEL分析

末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）dUTP缺口末端标记（TUNEL）测定已被设计用于检测呈现广泛DNA降解的凋亡细胞。该方法基于TdT标记独立于模板的双链DNA断裂的平末端的能力。

材料和试剂

玻璃瓶（Sigma-Aldrich，目录号：27151）
96孔板（VWR，目录号：734-2781）
载玻片（VWR，目录号：631-1551）
盖玻片（默克，目录号：S7117）
ApopTag Red原位凋亡检测试剂盒（默克，目录号：S7165）
10％正乙酰半胱氨酸（用PBS 1x稀释）（Sigma-Aldrich，目录号：A9165）
PBS 1x
37％甲醛（默克，目录号：104003）
1％SDS（用PBS 1x稀释）（Sigma-Aldrich，目录号：L3771）
30％H 2 O 2 （默克，目录号：107209）
漂白液
TdT酶（来自ApopTag Kit）
抗洋地黄毒苷 - 罗丹明（来自ApopTag Kit）
70％甘油（用PBS 1x稀释）
PBSTx（见食谱）
PBSTB（见食谱）

设备

平台振动筛
移液器
37°C培养箱
4°C冰箱
共聚焦显微镜

软件

ImageJ的

程序

将动物放入玻璃瓶中，用移液管移除涡虫水。
注意：动物应该在3毫米到5毫米之间。
将动物与5ml 10％N-乙酰半胱氨酸（在PBS中1x稀释）在室温下孵育5分钟，摇动。
注意：＆nbsp;
1. 虽然玻璃瓶正在摇摆，但要确保涡虫正确分离并与溶液接触。
2. 这一步杀死了动物并去除了厚厚的粘液涂层。
去除N-乙酰半胱氨酸，并在室温下用5毫升4％甲醛（用PBSTx稀释）固定动物20分钟，摇晃。
注意：每次换液都应该通过移液小心进行，但不要接触带有尖端的涡虫，以避免组织损伤。
除去固定剂并用5ml 1％SDS（在PBS中1x稀释）在室温下孵育动物20分钟，摇动。
除去先前的溶液，并在室温下用5ml PBSTx洗涤动物两次，每次5分钟，摇动。
取出洗涤液，用5ml 6％H 2 O 2 （在PBSTx中稀释）过夜，在白光下过夜，不摇摆。
注意：一夜之间大约16小时。请务必执行此漂白时间。
取出漂白液，在室温下用5毫升PBSTx洗涤动物两次，每次5分钟，摇匀。
注意：在此步骤中，动物可以在4°C下储存几天（不超过3天）。
取出洗涤液，用5ml PBS 1x冲洗动物。
小心地将动物转移到96孔板上。
注意：确保井中的所有动物都与溶液接触非常重要。如果您有几种动物，最好将它们分配到两到三个井中。
使用移液管移除PBS 1x并将动物与100μl在反应缓冲液中稀释的TdT酶（均来自ApopTag试剂盒）在37℃下孵育4小时，摇动。
去除TdT酶并用100μl终止/洗涤缓冲液（来自ApopTag试剂盒）冲洗动物。＆nbsp;
除去先前的溶液并用100μlPBSTB（PBSTx与0.25％BSA）在室温下洗涤动物两次，摇动5分钟。
取出洗涤液并用阻断溶液（均来自ApopTag试剂盒）稀释的100μl抗地高辛 - 罗丹明在室温下，在黑暗，摇摆下染色动物。
注意：从这个步骤到方案结束，动物应该保持在黑暗中。
除去先前的溶液并用100μl的PBSTB洗涤染色的动物4次，每次在室温下摇动10分钟。继续在4℃下在PBSTB中洗涤过夜，摇摆。
洗涤动物，直到在室温下用PBSTB获得清晰的信号（图3），摇动。
注意：每20/30分钟更换一次解决方案。
除去先前的溶液并向动物中加入70％甘油。
将动物转移到载玻片上并用盖玻片安装。必要时加入甘油。
注意：为避免甘油蒸发和样品中断，请在盖玻片周围涂上透明指甲油。请注意不要在动物身上涂上清漆。

图3. TUNEL检测的结果图像显示通过共聚焦显微镜成像的涡虫的尾部。白点对应于垂死细胞的细胞核。比例尺=250μm。

数据分析

使用共聚焦显微镜获取图像。＆nbsp;
分析ImageJ软件中的图像。

食谱

裂解缓冲液
Tris-HCl（pH 8）5mM
EDTA（pH 8）20 mM
特里顿0.5％
在冰上保留裂解缓冲液直至必要
分析缓冲区
HEPES（pH 7.5）20 mM
甘油10％
DTT 2 mM
在室温下保留测定缓冲液直至必要
PBSTx
含有0.3％Triton的1x PBS
PBSTB
PBSTx含0.25％BSA

致谢

这项工作得到了补助金BFU2008-01544和BFU2014-56055-P（MinisteriodeEducaciónyCiencia）和2009SGR1018（AGAUR）的资助。 N.S。得到了巴塞罗那大学APIF奖学金的支持。 Caspase-3活性测量和TUNEL测定方案分别改编自González-Estévez等人（2007）和Pellettieri 等人（2010）。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或竞争利益。

参考

Almuedo-Castillo，M.，Crespo-Yanez，X.，Seebeck，F.，Bartscherer，K.，Salo，E。和Adell，T。（2014）。 JNK控制涡虫干细胞有丝分裂的发生，并引发再生和重塑所需的凋亡细胞死亡。 PLoS Genet 10（6）：e1004400。
Baguñá，J。和Romero，R。（1981）。对涡虫中的生长，去除和再生过程中细胞类型的定量分析 Dugesia mediterranea 和 Dugesia tigrina 。 Hydrobiologia 84：181-194。
de Sousa，N。（2017）。博士论文。 Hippo通路在涡虫中的作用。巴塞罗那大学。
González-Estévez，C。和Salo，E。（2010）。涡虫中的自噬和细胞凋亡。细胞凋亡 15（3 ）：279-292。
González-Estévez，C.，Felix，D.A.，Aboobaker，A.A。和Salo，E。（2007）。 Gtdap-1 促进自噬，是再生过程中涡虫重塑的必要条件。饥饿。 Proc Natl Acad Sci U S A 104（33）：13373-13378。
González-Estévez，C.，Felix，D.A.，Rodriguez-Esteban，G。和Aboobaker，A.A。（2012）。在饥饿引起的涡虫增生过程中，新生母细胞后代减少并增加细胞死亡。 Int J Dev Biol 56（1-3）：83-91。
Miller，C.M。和Newmark，P.A。（2012）。胰岛素样肽可调节涡虫中的大小和成体干细胞。 Int J Dev Biol 56（1-3）：75-82。
Pellettieri，J。和Sanchez Alvarado，A。（2007）。细胞更新和成人组织稳态：从人类到涡虫。 Annu Rev Genet 41：83-105。
Pellettieri，J.，Fitzgerald，P.，Watanabe，S.，Mancuso，J.，Green，D.R。和Sanchez Alvarado，A。（2010）。在涡虫再生过程中细胞死亡和组织重塑。 Dev Biol 338（1）：76-85。