材料和试剂

材料
1. 移液器吸头（Interpath Services，目录号：39770,39730）
2. Hamilton ®注射器（Hamilton，目录号：80366）＆nbsp;
3. 组织培养塑料器皿（6孔板BD; 2,5和10毫升移液器SARSTEDT）
4. 具有低结合PES膜的Steritop-GP聚醚砜（孔径0.22μm）（Merck，Millipore，目录号：SCGPS05RE）
5. 巴斯德吸管（Biologix，目录号：30-0138A1）
生物材料
1. 慢病毒载体pFUGW-Pol2-ffLuc2-eGFP（Addgene，目录编号：71394）
2. OVCAR-5细胞系获自NCI，并使用短串联重复标记进行鉴定，以确认细胞与基因组计划数据库（Wellcome Trust Sanger Institute）的身份
3. HIV-1包装载体pCMV-deltaR8.2（Addgene，目录号：8455），来自墨尔本Peter MacCallum癌症中心的安德森实验室Cameron Johnstone博士赠送的礼物
4. 包装细胞系HEK293T（ATCC，目录号：CRL-3216），由Cameron Johnstone博士，安德森实验室，墨尔本Peter MacCallum癌症中心赠送
5. 小鼠：从Walter Eliza Hall Institute获得6-8周龄雌性无胸腺Balb / c小鼠，将其置于无病原体的12小时光 - 暗环境中，随意喂食用于肿瘤发生性测定。这种年龄范围的小鼠对于良好的肿瘤摄取率是最佳的，如果使用年龄较大的老鼠（例如，10周龄），它们会下降。
试剂
1. 牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：A9418-500G）＆nbsp;
2. DAPI：4'，6'-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：D9542-5MG）
3. DMEM（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：11965092）
4. Diflucan（Fluconozole）（Sigma-Aldrich，目录号：F8929）
5. D-荧光素：4,5-二氢-2-（6-羟基-2-苯并噻唑基）-4-噻唑甲酸钠盐（Gold Biotechnology，目录号：LUCNA-1G）
6. FuGENE 6（Roche Diagnostics，德国曼海姆）
7. 内皮基底培养基（EBM TM -2）（Lonza，目录号：CC-3156）
8. 内皮生长培养基（EGM TM -2）Singlequots TM （Lonza，目录号：CC-4147）＆nbsp;
9. 胎牛血清（FCS）（赛默飞世尔科技，Gibco TM ，目录号：10099141）
10. Forthane / Isoflurane（Sigma-Aldrich，目录号：792632）
11. HEPES pH 7.4（Sigma-Aldrich，目录号：H0887-100ML）
12. Matrigel TM （标准）（BD，目录号：356234）
13. 没有Ca 2 + 和Mg 2 + 的PBS（GE Healthcare，Hyclone，目录号：SH30256.FS）
14. 青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：15140122）
15. Polybrene（Sigma-Aldrich，目录号：107689）
16. 氯化钾（Sigma-Aldrich，目录号：P5405）
17. 磷酸二氢钾（Sigma-Aldrich，目录号：P5655）
18. RMPI-1640（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：11875）
19. 碳酸氢钠（Sigma-Aldrich，目录号：S5761）
20. 氯化钠（Astral Scientific，目录号：AMX190）
21. 磷酸氢钠（Sigma-Aldrich，目录号：S5136）
22. 胰蛋白酶0.05％（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：25300120）
23. 台盼蓝（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：15250061）
24. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）
25. RPMI-1640媒体（见食谱）

设备

移液器（康宁，目录号：4487,4488,4489）
血细胞计数器（ProSciTech，目录号：SVZ2NI0U）
细胞培养培养箱（NuAire，型号：NU-5510 / E）
离心机（Beckman Coulter，型号：Allegra X-12）
电子卡尺（Fisher Scientific，目录号：14-648-17）
SW28转子（Beckman Coulter，目录号：342207）
超速离心机（Beckman Coulter，型号：Optima TM XE-100）
荧光显微镜（Nikon Instruments，型号：Nikon A1 + 共聚焦显微镜）
Xenogen实时成像系统（IVIS Lumina II）
Becton Dickinson Biosciences FACS Diva TM 细胞分选仪

软件

Prism 6（GraphPad Inc.）
Photoshop CS 6.0（Adobe Inc.）
Metamorph（分子器件）
ImageJ（NIH软件）

程序

在下面的方案中，我们描述了荧光素酶成像，以测量在免疫受损小鼠中皮下注射后建立原发性肿瘤后OVCAR-5细胞的转移性扩散。然而，其他细胞类型同样适用于这种方法，并且我们已经使用该协议来跟踪OVCAR-8细胞的转移性扩散并监测体内体内的持久性和存活率与共同注射时OVCAR细胞（Sinha et al。，2016）。

慢病毒载体
根据澳大利亚政府基因技术监管机构办公室制定的指导方针和机构批准（＃09/2006），所有与慢病毒的合作都是在适当考虑生物安全问题的情况下进行的。复制缺陷3 rd 代慢病毒载体pFUGW-Pol2-ffLuc2-eGFP（Addgene质粒＃71394）表达来自水母 Aequorea victoria 的绿色荧光蛋白（GFP）和萤火虫荧光素酶通过HIV-1包装载体和VSV-G包膜糖蛋白（Sinha ）的共转染，使用基因（Day et al。，2009）转导该方案中的OVCAR-5细胞。等人。，2016）。
慢病毒生产
包装细胞系HEK293T用于产生用于转导OVCAR-5细胞的慢病毒（Sinha 等人，，2016）。简言之，将HEK293T细胞以每60mm平板2×10 5个细胞接种于含有10％FCS的3ml DMEM中，并使其在37℃下在含有5％的加湿培养箱中粘附并生长过夜。（v / v）CO 2 。然后使用FuGENE 6（Roche Diagnostics，Mannheim，Germany）以FuGENE（μl）：pFUGW-Pol2-ffLuc2-eGFP质粒DNA（μg）比例3：1转染HEK293T细胞，如下：
1. 在无血清培养基中加入适量的FuGENE 6，在室温下孵育5分钟。＆nbsp;
2. 使用260nm吸收确定质粒DNA的浓度;然后将其以适当的浓度添加到FuGENE /培养基混合物中，并在室温下孵育15分钟。＆nbsp;
3. 将FuGENE / DNA /培养基混合物逐滴添加到每60mm平板100μl的铺板细胞中。将板在37°C孵育24-48小时。＆nbsp;
4. 收集来自HEK293细胞的病毒上清液，将其置于无菌管中，并使用SW28转子在超速离心机中在25℃下以1,000×g g / g旋转90分钟;吸出培养基并将病毒沉淀重悬于1ml RPMI-1640培养基中。
慢病毒转导
1. 在感染前一天，将RPC-1640中的OVCAR-5细胞以每孔1×10 5个细胞铺板到6孔板中（Sinha et al。，2016）。
2. 对于待转导的OVCAR-5细胞的每个孔，将2.5μl10mg/ ml聚凝胺加入2ml培养基中，并加入500μl病毒上清液。这是感染鸡尾酒。＆nbsp;
3. 将OVCAR-5细胞与感染混合物在37℃下用5％CO 2 吸收12小时，吸出含有病毒的培养基并用新鲜培养基替换。
4. 使用荧光显微镜评估OVCAR-5细胞的转导效率，通过GFP阳性细胞的数量来判断。＆nbsp;
5. 在分选富集GFP阳性细胞之前，通过荧光显微镜传播转导的细胞并在培养物中扩增最多两次传代，监测GFP转导效率。分选，胰蛋白酶消化细胞并重悬于含有DAPI的封闭缓冲液（2％[v / v] FCS和2％BSA的PBS中，不含Ca 2+ 和Mg 2 + ）最终浓度为2μg/ ml。在BD FACS Diva TM 分选仪上分选和收集活细胞（DAPI阴性）GFP + 细胞，并在用于荧光素酶成像实验之前进行扩增。慢病毒转导效率极高，我们的实验室常规实现85-90％的转导效率，即使是原代细胞如周细胞也是如此。
GFP-荧光素酶 + OVCAR-5细胞培养及注射入小鼠的准备
1. 培养GFP-荧光素酶 + OVCAR-5细胞至80-90％汇合。
2. 使用无菌巴斯德吸管吸出培养基。
3. 用少量预热的PBS洗涤细胞单层，不含Ca 2+ 和Mg 2 + 。
4. 在37°C下加入适量0.05％胰蛋白酶，孵育1-2分钟。
5. 轻轻敲打板以移除粘附的细胞。
6. 用含有FCS的等体积培养基淬灭胰蛋白酶活性。
7. 将细胞悬浮液转移至离心管中，并在4℃下以400 x g 旋转5分钟。
8. 丢弃上清液。
9. 使用台盼蓝染色和血细胞计数器进行细胞计数。
10. 每只小鼠在100μlPBS/ Matrigel TM （5μg/ ml）混合物中重悬8×10 5个 5 -8×10 6 细胞在冰上。
动物准备
1. 使用带有26 G针头的Hamilton ®注射器，在前侧皮下注射100μl细胞悬液的免疫受损小鼠。（请参阅 https://youtube.com/watch?v=nrOTzLiWC8U 上的过程视频剪辑）
2. 注射后保持小鼠每日观察，以确保完全恢复，寻找压力的迹象。
3. 通过使用电子卡尺进行公制测量来监测肿瘤体积。
  注意：每隔一天监测OVCAR-5肿瘤。根据使用的细胞系的肿瘤生长速率修改方案。
荧光素酶成像
1. 在100μl无菌的D-荧光素PBS（荧光素酶的底物）中，每只体重150μg，在非肿瘤的侧腹皮下注射小鼠。
  注意：注射D-Luciferin后10-12分钟内获得成像。
2. 让小鼠自由活动6-8分钟。
3. 用氧气中的2.5％Forthane（商业异氟烷麻醉剂）麻醉小鼠。
  注意：注意不要麻醉超过3分钟。
4. 将麻醉的小鼠置于加热平台上的Xenogen实时成像系统的诱导室中的吸入锥体中。
5. 牢固地关闭室门。
6. 在信号衰减之前，在荧光素注射的10-12分钟内，以相同的曝光长度和时间间隔获取所有实验组的图像。
终点
1. 每7天重复上述荧光素酶成像（步骤F1-F6）以继续跟踪转移扩散。
2. 在实验终点，来自大的原发性肿瘤的发光信号饱和并且可以阻断来自较小转移性结节的信号。为了克服这个问题，给小鼠注射D-荧光素并允许自由运动6-8分钟，使动物安乐死并通过外科手术切除原发性肿瘤。手术打开腹腔，去除解剖部位上的皮肤组织进行成像，然后进行BLI，调整暴露长度以确保捕获来自较小转移性结节的信号。
  注意：所有实验均符合制度伦理委员会指导原则，该指南规定动物不应受到不适当的痛苦 - 每天监测实验动物的痛苦迹象，当肿瘤达到1,500 mm 3 （其中肿瘤体积= [宽度] 2 x长度x 0.5）即使这发生在实验的计划终点之前。注射后第35天以后未进行任何实验。

数据分析

通过BLI检测的转移扩散是定性测定，允许研究者确定特定实验条件（在这种情况下与周细胞共注射）是否导致转移。也可以比较特定实验条件下转移的发作时间 - 在这种情况下，确定OVCAR-5细胞与周细胞共同注射，导致比单独的OVCAR-5细胞更早发生转移，通过在不同的情况下成像时间点。然而，为了确定OVCAR-5细胞在特定时间点与周细胞共注射时始终产生转移性结节，每个实验组10只小鼠在几个时间点成像，每个实验重复两次。 BLI还可用于追踪非肿瘤细胞的持久性 - 如图2所示，通过用GFP-荧光素酶慢病毒转导周细胞并与未标记的OVCAR-5细胞共注射。

图2.体内OVCAR-5异种移植物中的周细胞追踪（Sinha et al。，2016）。单独由未标记的OVCAR-5细胞产生的异种移植物的BLI图像（A）;或者用GFP-荧光素酶标记的周细胞共注射OVCAR-5细胞（B）。在2个重复实验中，每组时间点每组3只小鼠进行成像。未标记的OVCAR-5肿瘤充当阴性对照，尽管注射了荧光素，但没有发出信号（A）。 OVGAR-5肿瘤的顺序BLI与GFP-荧光素酶标记的周细胞共注射，从第6天至第35天显示阳性BLI信号，表明在异种移植物中存在周细胞的持续存在（B）。
BLI可用于定量单独使用OVCAR-5细胞获得的转移性结节数量与同时注射周细胞的OVCAR-5细胞的数量，但最好在实验终点确定后处死动物并计算检测到的结节数量。来自两个独立实验的每组10只小鼠的BLI。然后将数据表示为每只小鼠的转移性结节的平均数±SEM，并使用单向ANOVA进行实验组之间差异的统计分析（图3）。此外，必须独立验证转移以通过独立方式确认其OVCAR-5细胞来源 - 因此收获每个转移性结节，通过使用针对GFP的抗体对GFP表达进行免疫染色的石蜡切片进行组织学分析。

图3.转移性结节的定量和免疫组织化学验证（Sinha et al。，2016）。 A.变异结节的数量变化在实验终点计数实验条件，揭示OVCAR-5细胞在第28天不产生转移，而与周细胞共同注射。增加周细胞的比例：肿瘤细胞导致转移性结节增加（比较OVCAR-5：周细胞比率为10：1对比1：1）。 B.GFP-荧光素酶 + OVCAR-5肿瘤的GFP染色从单独的OVCAR-5细胞或在肝脏和脾脏中用周细胞共注射（OVCAR-5 + P）产生，证实转移性结节由BLI检测到的是来自OVCAR-5细胞并且不归因于假信号。

笔记

检测到的BLI信号的绝对量取决于成像的GFP-荧光素酶 + 细胞的数量和荧光素注射后的暴露持续时间。因此，通过增加荧光素注射后的暴露持续时间，可以在肿瘤发展的早期阶段成像较小的肿瘤或较低数量的周细胞。但是，必须注意确保在实验中比较所有实验动物组的相同暴露量。＆nbsp;
通过BLI检测转移性结节受到其体内大小和位置深度的限制 - 它们从成像表面的位置越深，其检测机会越低。来自原发性肿瘤的强信号也可以消除来自小转移性结节的低信号。因此，虽然BLI是转移存在与否的良好指标，但建议使用实验终点来确定转移的全部程度和数量。在此阶段，处死动物，切除原发肿瘤，并在该区域移除皮肤以进行转移成像。＆nbsp;
由于可能将荧光素酶阳性细胞从一只动物转移到另一只动物，从而产生假阳性BLI读数，因此建议使用不同的手术工具从每只实验动物切除原发性肿瘤。这也使得关键是通过收获BLI阳性转移，在GFP染色后进行组织切片和免疫组织化学分析，验证BLI检测到的每个“转移性结节”确实来自GFP-荧光素酶标记的肿瘤细胞，如图3B所示。

食谱

磷酸盐缓冲盐水（PBS）
1. 溶解1克KCl; 1克KH 2 PO 4 ; 5.75g Na 2 HPO 4 和40g NaCl在约2L MillQ H 2 O中
2. 用MilliQ H 2 O使体积达到5L并充分搅拌直至所有成分溶解
3. 测量pH并调节至pH 7.0-7.5。确保渗透压为270±13 mM
4. 使用20升压力罐和Sartobran过滤器过滤灭菌
5. 储存在4°C
RPMI-1640媒体
1. 补充RPMI-1640含25 mM HEPES，1％青霉素 - 链霉素，1.5％Diflucan和10％（v / v）热灭活FCS
2. 为了使FCS热灭活，将FCS在56℃下孵育45分钟
3. 使用20升压力罐和Sartobran过滤器对RPMI-1640培养基进行过滤灭菌
注意：在本研究中，RPMI-1640用于培养OVCAR-5细胞系。

致谢

本文描述的技术在CASS基金会，维多利亚癌症委员会＃807184和NHMRC＃1025874授予PK的研究工作中得到优化;和国际HDR博士学位澳大利亚国立大学，堪培拉奖学金到DS。我们感谢Robin Anderson教授和Clare Slaney博士对BLI的宝贵讨论和技术建议。 ZP和PK由科廷大学健康科学学院授予的资金支持。该方案改编自我们在临床癌症研究中发表的实验室的先前研究（Sinha et al。，2016）。

利益争夺

作者没有利益冲突或竞争利益申报。

伦理

所有动物实验均在Peter MacCallum动物研究伦理委员会-AEEC（＃E394和＃E504）的批准下进行，参考国家卫生组织制定的动物伦理实验指南。澳大利亚医学研究委员会。

参考

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Day，C.P.，Carter，J.，Bonomi，C.，Esposito，D.，Crise，B.，Ortiz-Conde，B.，Hollingshead，M。和Merlino，G。（2009）。慢病毒介导的双功能细胞标记体内黑色素瘤研究。 Pigment Cell Melanoma Res 22（3）：283-295。
Rice，B.W.，Cable，M。D.和Nelson，M。B.（2001）。发光探针的体内成像。 J Biomed Opt 6（4）：432-440。
Sinha，D.，Chong，L.，George，J.，Schluter，H.，Monchgesang，S.，Mills，S.，Li，J.，Parish，C.，Bowtell，D.，Kaur，P。and 澳大利亚卵巢癌研究，G。（2016年）。 Pericytes促进小鼠恶性卵巢癌进展并预测浆液性卵巢癌患者预后不良。 Clin Cancer Res 22（7）：1813-1824。
Weissleder，R。（2001）。更明确的体内成像愿景。 Nat Biotechnol 19（4）：316-317。