材料和试剂

10厘米培养皿（康宁，目录号：430167，或等效物）
巴斯德吸管（Fisher Scientific，目录号：13-678-20A，或同等产品）
微量离心管（FroggaBio，目录号：LMCT1.7B，或同等产品）
PVDF膜（Bio-Rad Laboratories，目录号：1620177）
无菌0.45μmLuer-Lok注射式过滤器（颇尔，目录号：4614，或同等产品）
Luer-Lok无菌20 ml注射器（BD，目录号：302830，或同等产品）
无菌50毫升锥形管（FroggaBio，目录号：TB50-500，或等效物）
无菌移液器吸头（Diamed Advan Tech，目录号：DIATEC520-5376; DIATEC520-5876; DIATEC520-6501，或等效物）
聚碳酸酯管和盖子（Beckman Coulter，目录号：355618，或同等产品）
血清移液管，10 ml（Corning，目录号：4488，或等效物）
293T细胞（ATCC，目录号：CRL-3216）＆nbsp;
NIH 3T3（ATCC，目录号：CRL-1658）＆nbsp;
R187杂交瘤（ATCC，目录号：CRL-1912）
抗eGFP（Takara Bio，目录号：632381）
抗小鼠IgG，HRP结合（细胞信号，目录号：7076S）
抗大鼠IgG，HRP结合（默克，目录号：AP183P）
Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）高葡萄糖，含L-谷氨酰胺，丙酮酸钠和酚红（WISENT，目录号：319-005-CL，或等效物）
ECL（Bio-Rad Laboratories，目录号：1705060S [Clarity TM ]或1705062S [Clarity Max TM ]或等效物）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：12483020，或等同物）
HCl，36.5-38％（Fisher Scientific，目录号：A144S-500）
Hybridoma-SFM（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：12045076）
KCl（Fisher Scientific，目录号：BP366-500）
KH 2 PO 4 （Fisher Scientific，目录号：P285 500）
甲醇（转移缓冲液，参见配方）（VWR，目录号：56902-543）
Milli-Q水（或同等水）
Na 2 HPO 4 （Fisher Scientific，目录号：S393-3）
NaCl（Fisher Scientific，目录号：BP358-10）
NaOH，10N认证（Fisher Scientific，目录号：SS255-1）
青霉素/链霉素（GE Healthcare，目录号：SV30010，或同等学历）
聚乙烯亚胺（PEI）（Polysciences，目录号：23966-1，或同等学历）
十二烷基硫酸钠（SDS）（VWR，目录号：97064-496，或同等学历）
蔗糖（WISENT，目录号：800-081-LG，或同等学历）
Tris-Base（用于转移缓冲液，参见配方）（Fisher Scientific，目录号：BP152-5）
Triton X-100（VWR，目录号：97062-208，或同等产品）
10x PBS（见食谱）
1x PBS（见食谱）
PBS-T（见食谱）
PBS中20％（m / v）蔗糖（参见食谱）
PBS中5％（m / v）蔗糖中的2％（v / v）Triton X-100或0.2％（m / v）SDS（参见配方）
完整的DMEM（见食谱）
转移缓冲液（25x）（见食谱）

注意：我们使用VWR作为Pall＆amp; amp;的分销商。康宁产品。

设备

移液器（Gilson，目录号：F167700，或等效物）＆nbsp;
0.22μmSteritop®过滤器（Merck，目录号：SCGPT10RE，或同等产品）
平衡（Fisher Scientific，目录号：01-919-358，或等效物）
制造商：Ohaus，目录号：30100606 / RM。
生物安全柜（Thermo Fisher Scientific，型号：1323TS，或同等产品）
Digital Imager（GE Healthcare，型号：ImageQuant LAS 4000，目录号：28955810，或同等产品）
冰箱（4°C）（惠而浦，型号：WRT148FZDM，或同等产品）
血细胞计数器（Hausser Scientific，Bright-Line TM ，目录号：3100，或等效物）
显微镜（Fisher Scientific，目录号：LMI6PH2，或等效物）
制造商：Laxco，目录号：LMI6PH2。
冷藏台式离心机（Thermo Fisher Scientific，型号：75004524，或同等产品）
组织培养箱，湿度，温度和CO 2 调节（Thermo Fisher Scientific，型号：3110，或等效物）
70Ti型转子（Beckman Coulter，目录号：337922，或同等产品）
超速离心机（Beckman Coulter，型号：969347，或同等产品）

程序

有关此协议中使用的两种方法的概述，请参阅图1。

图1.逆转录病毒衣壳核心稳定性测定概述。图改编自Renner et al。，2018a。 A.方法1.通过用去污剂的初始处理，去除逆转录病毒的包膜磷脂双层包衣。将这些包膜缺陷（无Env）衣壳进行超速离心，在进入不含去洗涤剂的蔗糖溶液之前将其短暂暴露于另外的洗涤剂处理。含有20％蔗糖的底层密度允许完整衣壳的有效沉淀，但是对于沉淀游离CA蛋白和较低密度的蛋白质复合物是一个障碍。 B.方法2.可以在没有对天然病毒进行洗涤剂预处理步骤的情况下进行类似的方法。在这种情况下，病毒对蔗糖柱中的洗涤剂层的抵抗力稍强。组合执行这些方法将提供关于病毒衣壳核心稳定性的信息性结果。然后使用对CA蛋白特异的抗体，在这种情况下使用M-MLV的p30，通过SDS-PAGE分析沉淀。
在8ml完全DMEM中，用病毒生产细胞（即，产生代表性病毒颗粒的活细胞）种子10cm培养皿。对于该测定，我们通常用2×10 6个 6 NIH 3T3细胞接种2个培养皿，慢性感染MLV。或者，可以用表达病毒的质粒转染细胞（例如293T）（参见注释1和2）。
让细胞繁殖并在37℃，5％CO 2 中产生病毒，直至达到汇合;这应该需要大约72-96小时。汇合是由于井的生长表面缺乏表面积而决定的。＆nbsp;
在收集病毒上清液之前，将超速离心机预冷至4°C。
使用血清移液管收集病毒上清液（约15ml），并将其转移到50ml锥形管中。在这些条件下，这是一种过量的病毒，如果需要，可以在SDS-PAGE分析中进行多次尝试。
在室温（20-25℃）下将该上清液在500μM/孔下离心5分钟以清除细胞碎片。
在该离心步骤期间，准备适当数量的注射器和0.45μm过滤器。
将澄清的上清液转移到注射器中，并将其直接过滤到另一个50 ml锥形管中。
1. 方法1：加入Triton X-100至终浓度10％（即，1.7 ml Triton X-100 + 15 ml病毒上清液），通过倒置或移液混合。在室温（20-25°C）下孵育20分钟（见注3）。
2. 方法2：转到第9步。＆nbsp;
将溶液转移到70Ti型管中。
如有必要，用培养基或PBS加满每个管，使其含有低于最大阈值约7.5ml。
将无菌巴斯德吸管放入每个70Ti管中，将薄侧浸入病毒培养基中。以这种方式放置和使用巴斯德吸管显示在我们实验室最近出版物的图2中（Renner et al。，2018b）。＆nbsp;
慢慢加入无菌的5％蔗糖 - 去污剂缓冲液，2毫升就足够了（见注4）。这允许在通过更致密的20％蔗糖溶液之前短时间暴露于洗涤剂，该溶液不含洗涤剂。在我们的实验中，我们通常使用5％蔗糖+ 2-10％Triton X-100或0.2％SDS。＆nbsp;
使用相同的巴斯德吸管，通过巴斯德吸管缓慢添加无菌20％蔗糖溶液，使其在洗涤剂层下方形成缓冲层（见注4）。 5毫升这种解决方案就足够了。＆nbsp;
将盖子和盖子插入管子上并适当平衡每根管子以进行超速离心（0.05克以内）。无菌培养基或PBS可用于调整病毒样本的质量（见注5）。
盖上每根管子，确保O形圈和铝盖正确密封。将这些管子适当地插入70Ti型转子中，然后将转子插入超速离心机（见注5）。
超速离心这些样品，加速和减速设定为最大值，在4°C下保持2小时，约100,000 x g 。
从转子上取下管子，观察颗粒并用标记圈住。这些颗粒是相当半透明的，带有白色调，因为在这个阶段应该从它们上剥去外壳。随着离心后的时间过去，这些颗粒变得更难以看到并且可能会脱落，因此样品需要尽快处理。＆nbsp;
使用血清移液管轻轻移除上清液，并将沉淀重悬于所选的缓冲液中。我们通常使用250μlLaemmli样品缓冲液进行SDS-PAGE分析。缓慢而小心地重悬，以避免引入气泡。
储存在-20°C或-80°C直至准备分析。

数据分析

SDS-PAGE：
病毒衣壳核心稳定性可通过量化基本病毒组分来确定;由于磷脂双层将从衣壳中解离，预计会发生病毒包膜糖蛋白的丧失。底部蔗糖层的密度将控制该测定的严格性和总产率。对于M-MLV，我们靶向p30衣壳蛋白（R187，大鼠单克隆，1μg/ ml）和病毒包膜糖蛋白Env-eGFP（抗eGFP，JL-8，小鼠单克隆，0.2μg/ ml）。对于p30衣壳抗体，R187细胞在ATCC使用Hybridoma-SFM概述的条件下繁殖。可以使用蛋白A或G树脂直接使用或纯化上清液。剩余的抗体，包括次级抗体，按照材料和试剂部分所述购买。
＆NBSP;这种方法和必要的背景信息在我们最近出版的 Journal of Virology （Renner et al。，2018a）中进行了说明和解释。该方案的开发是为了评估由各种病毒结构蛋白和称为糖基化Gag（也称为glycogag或gPr80）的辅助蛋白中的突变引起的对核心稳定性的影响。下面的图2描绘了病毒蛋白中每个突变的定位。名为M-MLV [CTA]的病毒突变体特异性地描述了gPr80的CTG替代起始密码子的丢失，使得该病毒缺乏该蛋白质。其他突变体表达缺乏糖基化位点的gPr80。这些突变因此影响基质（N113）和CA（N480和N505）结构蛋白。

图2.糖基化Gag（gPr80）蛋白的示意图。该图改编自Renner et al。，2018a。 gPr80的翻译起始于替代的起始密码子CTG（氨基酸（AA）位置1）。 N - 连接的糖基化发生在AA位置113,480和505.如上所述，这些位于Pr65的基质（MA / p15）和衣壳蛋白（CA / p30）蛋白的编码序列中。，分别。

下面的图3概述了使用该协议的方法1和2获得的实现和数据的示例。每种凝胶的第一道显示未处理的病毒原种对照，以验证输入病毒的质量。方法1涉及用Triton预处理病毒，完全去除病毒包膜，如通过蛋白质印迹丧失Env-eGFP染色所描绘的（图3A）。该方法清楚地表明，gPr80表达的丧失或N480的突变导致可检测的衣壳核心稳定性降低（p30信号），而突变N113和N505似乎不会使衣壳核不稳定。
＆NBSP;方法2，其不涉及用去污剂预处理，描绘了随着去污剂浓度的增加病毒包膜的逐渐丧失，如通过减少Env-eGFP染色所示（图3B）。该方法说明当将WT M-MLV与gPr80缺陷型病毒和N113Q / N480Q / N505Q突变体进行比较时，衣壳核心稳定性的类似降低。此外，方法2揭示了在图3A中不可见的gPr80缺陷型病毒和N113Q / N480Q / N505Q突变体之间的更微妙差异。主要是，[N113Q / N480Q / N505Q]在温和洗涤剂存在下比gPr80缺陷型病毒更稳定。这些结论反映在我们最近的出版物（Renner et al。，2018a）中与衣壳测定的命运的直接比较中。

图3.病毒衣壳核心稳定性的评估。该图改编自Renner et al。，2018a。如前所述从细胞上清液中收获各种M-MLV糖基化的Gag突变体。每个条带的强度与抗体的量成正比，因此样品中存在抗原;条带越强，感兴趣的蛋白质就越多。 A.用10％Triton X-100预处理病毒以除去包膜（方法1）。然后将病毒通过含有5％蔗糖的第一层与2％Triton X-100或0.2％SDS一起旋转（图1）。然后通过SDS-PAGE分析超速离心沉淀。 B.病毒未经任何洗涤剂预处理（方法2）。第一条泳道代表未经洗涤剂处理的样品，而接下来的3条泳道描绘了在上部5％蔗糖层内浓度增加的洗涤剂处理（图1）。没有包膜糖蛋白条带（Env），但在SDS-PAGE分析中存在p30（衣壳）条带说明了在超速离心后存活的无包膜和完整衣壳核心。 p30染色减少或缺失突出显示衣壳结构稳定性降低。

总的来说，这里提出的两种技术方法分别构成了快速，简单和有效的方法来监测逆转录病毒的衣壳核心稳定性。另外，通过并行使用这两种方法，可以重复地揭示衣壳核心稳定性的微小但显着的差异。方法1挑战了剥去包膜的裸衣壳的结构稳定性;方法2探索用温和的非离子表面活性剂攻击的完整的天然病毒的总体稳定性。最后，将这两种方法的结果与衣壳测定的良好表征的命运进行了比较，这在我们的系统中得出了类似的结论，但构成了一种更加劳动密集且耗时的方法（Renner et al。，2018a）。

笔记

细胞类型将根据该测定的选择病毒而变化。选择NIH 3T3细胞是因为它们易于使用，同时对MLV感染和生产具有高度许可性。如果慢性感染的生产细胞不是可行的选择，则使用该方案也已证实合适细胞系的转染是有效的。对于转染，请遵循所选试剂的已发布指南。
最佳生产时间可能因病毒或细胞类型而异。＆nbsp;
由于它们的粘度，移液洗涤剂原料可能很难。用剪刀切割移液器吸头的末端可能会有所帮助。或者，确定质量所用洗涤剂的体积可能更准确。选择的洗涤剂和孵育时间可根据病毒和实验条件而变化。建议在非变性条件下进行优化。
如果发现多层蔗糖层的分层（即，层明显混合）有困难，可以在加入病毒上清液之前用液氮分别冷冻这些层。这可以通过将仅含有蔗糖底层的管浸入液氮容器中来完成。可以在冷冻底层的顶部进行第二层的添加而不用担心混合。在添加样品的同时，可以再次将管浸入以将两个层冻结在适当位置。这将确保在离心步骤开始之前层的适当分离。但是，可以肯定的是，正在使用的离心管与液氮的低温相容。
当用这些管操纵时要非常小心，因为蔗糖层可以与病毒上清液混合。重要的是所有层保持清晰和分离。

食谱

10x PBS
80 g / L NaCl
2克/升KCl
7.63g / L Na 2 HPO 4
2.4 g / L KH 2 PO 4
消毒，如果长期保存
注意：我们通常制作一个10倍的PBS原液，以减少与称量这些粉末相关的误差的重要性。
1x PBS
根据需要将10x PBS稀释至含有蒸馏水的1x PBS溶液中使用NaOH或HCl将pH调节至7.4并进行灭菌储存在4°C至25°C之间
PBS-T
加入Tween-20至终浓度为0.1％（v / v）（每升1 ml）至1x PBS
在室温下储存
PBS中20％（m / v）蔗糖
200克蔗糖
100毫升10倍PBS溶液
用无菌H 2 O将体积调至1L 使用NaOH或HCl将pH调节至7.4
过滤消毒
存放在冰箱（4°C）
在PBS中的5％（m / v）蔗糖中的2％（v / v）Triton X-100或0.2％（m / v）SDS
2.5克蔗糖
1毫升Triton X-100或0.1克SDS
5毫升10倍PBS溶液
用无菌H 2 O将体积调至50ml 使用NaOH或HCl将pH调节至7.4
过滤消毒
在室温下储存
注意：如果需要不同百分比的Triton X-100或SDS，请相应地向上或向下扩展。
完成DMEM
（10％FBS，100U / ml青霉素，100μg/ ml链霉素）
DMEM高糖葡萄糖
50毫升胎牛血清
5毫升青霉素/链霉素溶液
存放在冰箱（4°C）
转移缓冲液（25x）
72.8克Tris-Base
360克甘氨酸
用无菌H 2 O将体积调至2L 在室温下储存
在使用前，用20％总体积的甲醇稀释至1倍，剩余的无菌H 2 O（即，1 L总体积= 200 ml甲醇，40 ml 25x转移缓冲液和760ml无菌H 2 O）。

致谢

M.-A.L.拥有加拿大分子病毒学和内在免疫研究主席。这项研究得到了加拿大卫生研究院的资助（拨款89774）和安大略省研究与创新部颁发给M.-A.L的早期研究员奖。 T.M.R.持有安大略省QEII研究生奖学金。

该方案在Journal of Virology（Renner et al。，，2018a）中进行了优化和简要描述。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或竞争利益。

参考

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