材料和试剂

细胞培养
1. Falcon ® 15毫升聚苯乙烯离心管，圆锥形底部，带圆顶密封螺帽，无菌（康宁，目录号：352095）
2. 计数室（KOVA ® Glasstic Slide 10 with Grids）（Kova International，目录号：87144）
3. 96孔细胞培养微孔板，底部透明（Greiner Bio One International，目录号：655090）
4. 带有可倾斜颈部和过滤器盖的75 cm 2 组织培养瓶（TPP Techno Plastic Products，目录号：009076）
5. 人上皮HeLa细胞（ATCC，目录号：CCL-2）
6. Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）1x，高葡萄糖，GlutaMax TM （Thermo Fisher Scientific，目录号：10566016），补充10％（v / v）热灭活胎牛血清（Sigma-Aldrich），目录号：F7524）＆nbsp;
7. DPBS 1x（Thermo Fisher Scientific，目录号：14190144）
8. 0.05％胰蛋白酶-EDTA 1x（Thermo Fisher Scientific，目录号：25300054）
9. 热灭活的胎牛血清（Sigma-Aldrich，目录号：F7524）（参见热灭活配方）
细菌培养
1. 接种环（SARSTEDT，目录号：86.1562.010）
2. Falcon ®带有卡帽的14毫升圆底管（Corning，目录号：352006）
3. 圆形培养皿（Corning，Gosselin TM ，目录号：BP93B-102）
4. 储存在-80°C的细菌甘油原料（实验室收集）
  1. SL1344 pM965，在rpsM启动子下表达GFP。用Stecher及其同事描述的pM965质粒（Stecher 等人，2004）转化SL1344后获得菌株。请参阅配方以进行转换。
  2. SL1344 pGG2，在rpsM启动子下表达dsRed。用Lelouard及其同事描述的pGG2质粒转化SL1344后获得菌株（Lelouard 等人，，2010）。请参阅配方以进行转换。
5. Electroporation Cuvettes（Bio-Rad Laboratories，目录号：1652086）
6. 氨苄青霉素（Sigma-Aldrich，目录号：A9393）（在-20°C下保存50 mg / ml的储备溶液）
7. 胰蛋白胨（BD，目录号：211705）
8. 酵母提取物（BD，目录号：212750）
9. NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：746398）
10. 含有氨苄青霉素的LB琼脂平板，浓度为100μg/ ml（自制，参见食谱）
11. Lysogeny肉汤（LB）培养基补充0.3 M NaCl（自制，参见食谱）

感染
1. 1.5毫升Eppendorf安全锁管（Eppendorf，目录号：0030120086）
2. 半微量一次性比色皿（BRAND，目录号：759105）
3. Parafilm ® M密封胶带（Sigma-Aldrich，Parafilm，目录号：P7543）
4. 移液器，25 ml（Thermo Fisher Scientific，目录号：10717964）
5. 过滤嘴，200μl（Sorenson Bioscience，目录号：035230）
6. 庆大霉素溶液（Sigma-Aldrich，目录号：G1397）（在-20°C下保持50 mg / ml的储备溶液）
7. NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：746398）
8. KCl（赛默飞世尔科技，目录号：13305）
9. CaCl 2 （Sigma-Aldrich，目录号：449709）
10. MgCl 2 （Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
11. 葡萄糖（西格玛奥德里奇，目录号：G8270）
12. HEPES（西格玛奥德里奇，目录号：H3375）
13. 热灭活的胎牛血清（Sigma-Aldrich，目录号：F7524）（参见热灭活配方）
14. 20x EM介质（自制，参见食谱）
15. 1x EM介质（见食谱）

固定
1. 铝箔
2. 多聚甲醛16％溶液（Electron Microscopy Sciences，目录号：15710）
3. DPBS 1x（Thermo Fisher Scientific，目录号：14190144）

染色
1. CellMask TM 深红色质膜染色（Thermo Fisher Scientific，目录号：C10046）
2. DAPI（Thermo Fisher Scientific，目录号：D1306）（储存于-20°C的10 mg / ml储备溶液）
3. DPBS 1x（Thermo Fisher Scientific，目录号：14190144）

设备

单通道移液器（Eppendorf，型号：Research ® plus）
多通道移液器，30至300μl（Thermo Fisher Scientific，目录号：4661030N）
移液器（Thermo Fisher Scientific，目录号：9501）
倒置显微镜（Motic，型号：AE2000）
层流罩（赛默飞世尔科技，型号：1300系列II级A2型）
孵化器设定在37°C，5％CO 2 （Thermo Fisher Scientific，目录号：NC0689918）
离心机5810/5810 R（Eppendorf，型号：5810/5810 R）
带有轨道振动筛的培养箱（INFORS，Multitron no series 112569-3）
水浴（JULABO，型号：TW12，目录号：9550112）
Thermomixer compact（Eppendorf，型号：ThermoMixer ® C）
光度计（Eppendorf，AG 22331）
离心机5424/5424 R（Eppendorf，型号：5424/5424 R）
通风橱（SORBONNE ASPRIL / 1000）
倒置宽视野显微镜配备20x / 0.5NA空气物镜，自动可编程XY平台，聚焦系统（尼康），CoolSnap2相机（Roeper Scientific），水银灯和以下滤光片立方体：DAPI（激发滤光片： 387/11，发射滤光片：447/60），FITC（激发滤光片：482/35，发射滤光片：536/40），TRITC（激发滤光片：543/22，发射滤光片：593/40）Cy5（激发滤光片： 628/40，发射滤光片：692/40）
250毫升Erlenmeyer烧瓶
电穿孔系统（Bio-Rad Laboratories，型号：Gene Pulser Xcell TM ）
双锅炉：2升烧杯，装满600毫升水
微波炉

软件

NIS元素显微镜成像软件（尼康）
Icy（版权所有2011 Institut Pasteur，Icy是GNU通用公共许可证条款下的免费软件， http：//icy.bioimageanalysis .ORG ）
R（R是GNU通用公共许可证条款下的免费软件， https://www.r-project。组织/ ）。数据分析部分中可用的代码是用R，版本3.4.2编写的
GraphPad Prism版本7.00 for Windows，GraphPad Software（La Jolla California USA， www.graphpad.com ）

程序

注意：除非另有说明，HeLa细胞和细菌应在无菌层流BSL-II罩下处理。该方案描述了表达荧光团的沙门氏菌感染HeLa细胞，但可以适应其他细胞系和病原体。特别是，非荧光病原体也可以通过免疫荧光标记。

感染前2天培养细菌
1. 取出一小瓶储存在-80℃的细菌SL1344-pGG2（dsRed）和SL1344-pM965（GFP）的甘油储液。
2. 在含有适当抗生素（此处为氨苄青霉素）的LB琼脂平板上敲击细菌，以允许两种菌株形成单菌落。
3. 将细菌在37°C孵育过夜。
4. 第二天，将板保存在4°C。培养皿可以保存一周（图1，见注1）。
  
  图1.培养皿上的细菌培养。 SL1344-pGG2（dsRed）和SL1344-pM965（GFP）在含有抗生素（氨苄青霉素）的培养皿上敲击。单个菌落以灰色圈出。
感染前1天培养细菌
1. 向两个Falcon 14ml聚丙烯圆底管中加入3ml补充有0.3M NaCl和50μg/ ml氨苄青霉素的LB培养基。
2. 使用相同的接种环从培养皿中挑取一个菌株的3个菌落，并将它们加入第一个管中。在第二个管中用第二个菌株重复该步骤。
3. 在37°C下在搅拌（220 rpm）下在45°旋转的架子中孵育过夜（参见注释2）。
感染前1天细胞培养
1. 使用水浴在37°C下预热培养基（胰蛋白酶，DMEM + 10％FBS，DPBS 1x）。
2. 基于细胞密度的显微镜观察，取约80％汇合的含有HeLa细胞的75cm 2 的组织培养瓶。
3. 用5ml温热的PBS 1x洗涤细胞。
4. 加入5ml温热的0.05％胰蛋白酶-EDTA，并在37℃，5％CO 2 的培养箱中孵育细胞5分钟。
5. 通过小心地击打侧面的烧瓶并沿着烧瓶表面移动介质来分离剩余的附着细胞。
6. 在显微镜下检查胰蛋白酶作用的效率：细胞应该是圆形的并且完全与烧瓶表面分离。如有必要，孵育更长时间。
7. 通过添加5ml DMEM + 10％FBS来停止胰蛋白酶作用。
8. 重悬细胞并将烧瓶中的所有内容物转移到15ml Falcon ®管中。
9. 使用Centrifuge 5810/5810 R（参见注释3）将细胞在200 g g离心4分钟。
10. 丢弃上清液。
11. 将细胞沉淀重悬于温热的DMEM + 10％FBS培养基中。
12. 将15μl细胞悬浮液转移到细胞计数器室中。
13. 使用台式显微镜和细胞计数器计数细胞计数器室中的细胞。
14. 计算初始细胞浓度（Ci）。
15. 计算所需细胞的体积（Vi）以获得最终体积（Vf）为2ml的最终浓度（Cf）为1.5×10 4 sup / ml细胞/ ml。使用以下公式：
  
  Vi = Cf x Vf / Ci
16. 在新的Falcon ®管中稀释DMEM + 10％FBS培养基中的细胞。
17. 取96孔细胞培养微孔板并标记板图。在该方案的以下部分中，我们考虑使用该板的16个孔（参见注释4，图2）。
18. 每孔加入100μl细胞稀释液。
19. 在细胞周围的孔中加入100μlPBS（1x）（见注4，图2）。
  
  图2. 96孔板中的细胞培养。细胞占据B2至B9和C2至C9的孔。周围的井充满PBS 1x（见注4）。
20. 将96孔板保持在37℃，5％CO 2 的培养箱中24小时。
感染
1. 通过在3ml补充有0.3M NaCl和50μg/ ml氨苄青霉素的LB培养基（稀释1:21）中稀释150μl过夜细菌培养物，对每种细菌菌株进行传代培养。
2. 将培养基在培养箱的45°培养架中于37℃与轨道振荡器以220rpm一起孵育3小时（参见注释5）。
  重要提示：3小时后应重复步骤D1和D2，以准备第二次感染所需的继代培养。
3. 在层流罩下，制备4ml含有EM培养基的“ Gent100 ”溶液，所述EM培养基补充有10％FBS和庆大霉素，浓度为100μg/ ml。
  注意：将400μlFBS与8μl庆大霉素以50 mg / ml混合，并加入3,592μlEM。
4. 在层流罩下，制备2ml含有EM培养基的“ Gent10 ”溶液，所述EM培养基补充有10％FBS和庆大霉素，浓度为10μg/ ml。
  注意：将200μlFBS与0.8μl庆大霉素以50 mg / ml混合，并加入1,799.2μlEM。
5. 使用水浴将EM介质，Gent100和Gent10溶液预热至37°C。
6. 使用恒温混合器在37°C下预热四个空的Eppendorf管。
7. 在孵育3小时结束时，在400μlLB培养基（体积最终500μl，稀释度1：5）中稀释100μl细菌继代培养物，将稀释液转移到两个半微量一次性比色皿中，用封口膜密封。并使用光度计测量OD。稀释液的OD应为约0.4，对应于细菌生长的晚对数期。
8. 通过从细胞孔中除去DMEM + 10％FBS培养基并每孔加入100μlEM培养基来制备HeLa细胞用于感染。将板保持在37℃，5％CO 2 直至感染。
9. 将来自步骤D2的500μl两种细菌继代培养物转移到温热的一个空的Eppendorf管中。
10. 使用Centrifuge 5424 / 5424R离心Eppendorf管1分钟，在7,600 x g 。
11. 弃去上清液，将细菌沉淀重悬于500μl温EM培养基中。
12. 再次离心Eppendorf管（洗涤步骤）1分钟，在7,600 x g 。
13. 弃去上清液，将细菌沉淀重悬于500μl温EM中。
14. 在400μlEM培养基中稀释100μl细菌悬浮液（最终体积500μl，稀释度1：5）。将稀释液转移到两个半微量一次性比色皿中，并使用光度计测量OD。
15. 使用以下计算方法计算最终感染复数（MOI）为30的稀释度：
  1. 想要浓缩细菌（Cf）：
    30 x（3.5 x 10 4 细胞/孔）= 1.05 x 10 6 细菌/孔
    ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆nbsp; = 1.05 x 10 7 细菌/ ml
  2. 要收集的初始体积（Vi），最终体积（Vf）为0.5 ml：
    Vi =（Cf×Vf）/ Ci
    Vi =（1.05 x 10 7 x 0.5）/（OD x 5 x 10 9 ）
16. 在剩余的两个空的温热Eppendorf管中准备两个稀释液，用于SL1344-pGG2（dsRed）和SL1344-pM965（GFP），用温EM完成体积（见注6）。
17. 使用多通道移液器从96孔板的每个孔中取出培养基。
18. 根据平板图将50μl细菌稀释液加入每个孔中（图3）。
  
  图3. 96孔板的感染图。第一轮感染。
19. 将96孔板在37℃，5％CO 2 的培养箱中孵育30分钟。
20. 使用多通道移液器和移液容器，每个孔使用100μl温EM清洗3次（图4）。
  
  图4.使用多通道移液器和移液器的清洗步骤
21. 在每个孔中将培养基更换为100μl的Gent100溶液。
22. 将细胞在37℃，5％CO 2 的培养箱中孵育1小时。
23. 将培养基更换为每孔100μl的Gent10溶液（见注7）。
24. 将细胞在37℃，5％CO 2 的培养箱中孵育1小时。
25. 用100μl温EM培养基洗涤细胞两次，以除去剩余的庆大霉素。
26. 在步骤D6至D22之后继续进行第二次感染并使用第二次感染图（图5）。
  
  图5. 96孔板的感染图。第二轮感染。
固定（在通风橱下）
1. 通过稀释DPBS 1x中的16％PFA制备700μl的4％PFA。
2. 从96孔板的每个孔中取出培养基，并向每个孔中加入40μl的4％PFA。
3. 在室温（RT）下孵育平板15分钟。从该步骤开始，使用铝箔保护板免受光照。
4. 取出PFA，用100μlDPBS洗涤3次，使用多通道移液器和移液槽。

染色
1. 在1ml DPBS中以1：1,000稀释CellMask并以1：1,000稀释DAPI以制备“染色混合物”。
2. 每孔加入40μl染色混合物，在室温下孵育20分钟。
3. 使用多通道移液管和移液容器用100μlDPBS洗涤孔3次。
4. 将板保持在4°C，每孔加入100μlDPBS，避光（用铝箔）直至在显微镜下采集（见注8）。
自动显微图像采集
1. 使用配备20x / 0.5NA空气物镜的尼康倒置宽视野显微镜和NIS软件获取96孔板的图像。
2. 使用JOBS Explorer，设置自动采集管道，如图6至图12所示：
  1. 为管道命名并选择存储类型为.nd2（图6）。
    
    图6.创建自动获取管道。红色箭头指向与步骤G2a相关的管道部分。
  2. 定义要捕获的通道（图7）。曝光时间与“CoolSNAP HQ2设置”面板中的相同。它需要适应每个实验。
    
    图7.用于图像捕获的参数定义。红色箭头指向与步骤G2b相关的管道部分。
  3. 从参考列表中单击“从DB中选择...”或通过单击“自定义孔板”（图8）定义板特性，选择所使用的板类型。
    
    图8.选择使用的板类型。红色箭头指向与步骤G2c相关的管道部分。
  4. 通过定义板的3个孔的边界来对齐板（图9）。
    
    图9.板的对齐。红色箭头指向与步骤G2d相关的管道部分。
  5. 选择要采集的板的孔（图10）。
    
    图10.选择要采集的井。红色箭头指向与步骤G2e相关的管道部分。
  6. 生成要获取的视野（图11）。
    
    图11.要获取的字段的生成。红色箭头指向与步骤G2f相关的管道部分。
  7. 选择图像捕获的参数，如图12所示。
    
    图12.捕获过程的定义。红色箭头指向与步骤G2g相关的管道部分。
  8. 进行收购。采集时间取决于井的数量和每个井的位置数量，通常持续数小时。文件会自动保存。所获得的图像的示例在相关出版物的图1中提供（Voznica 等人，，2018）。＆nbsp;

数据分析

自动图像分割
Icy是由巴斯德研究所的BioImage分析团队开发的用于图像处理的开源软件（de Chaumont et al。，2012），可在线获取（ http://icy.bioimageanalysis.org ）。其图形界面称为“协议”，可以创建用于图像处理的管道。
＆NBSP;下面介绍的整体管道可以在此处下载。为了获得精确的结果，需要在实验之间调整所有检测参数，以平衡采集之间的潜在变化（见注9）。在相关出版物的图S5中提供了所获得的图像分割的示例（Voznica 等人，，2018）。
＆NBSP;每个处理步骤表示为可以链接在一起的“块”（图13）。每个识别的对象称为“感兴趣区域”（ROI）。一个块的输出（例如ROI列表）通常用作另一个块的输入（参见注释10）。
1. 管道和迭代的一般架构
  1. 使用“文件夹”块设置包含图像集的原始文件夹。其输出转到“文件批处理”块。
  2. 使用“文件批处理”块在原始文件夹中包含的所有图像集上执行管道。 “文件批处理”包含块“附加文件名”和“序列系列批处理”。“序列系列批处理”包含所有后续分析步骤的块。
  3. 使用“附加文件名”块来存储文件的名称。这用于命名输出文件。
  4. 使用“序列系列批处理”对每个获取的视野执行图像处理，进一步称为“图像序列”。每个图像系列包含4个通道：含有细胞核的DAPI通道，含有GFP- 沙门氏菌的FITC通道，含有dsRed- 沙门氏菌的TRITC通道和含有标记的HeLa细胞的Cy5通道与CellMask。
  5. 使用“整数”块来存储要分析的图像序列的编号。这用于识别来自同一图像的细胞。
  图13.管道的一般架构
2. 从DAPI通道鉴定个体细胞核（图14）
  1. 使用“提取通道”块从图像系列中提取DAPI通道。它的输出转到“HK-means”块。
  2. 使用“HK-means”块将图像分割成特定尺寸范围内的ROI（此处为细胞核）。＆nbsp;
  3. 使用“在ROI中填充孔”块以获得无孔的完整原子核。 ROI输出用于“添加ROI到序列”和“活动轮廓”的块，这些块进一步用于分割单个单元。
  4. 使用“添加ROI序列”将新创建的ROI转换为二进制图像。该二进制图像用作块“ROI统计”的输入。
  5. 使用“ROI统计”来测量这些原子核的不同特征（XY位置，等。）。
  图14.自动图像处理管道的第一部分。从DAPI通道提取到细胞核统计的测量。
3. 从Cy5通道鉴定单个细胞（图15）
  1. 使用“活动轮廓”块来分割单个单元格。该算法使用先前为核检测到的ROI作为初始细胞ROI，其被扩展直到检测到细胞边界。
  2. “活动轮廓”块需要具有确定阈值的二进制图像。使用“Thresholder”块从Cy5通道创建过滤后的二进制图像，并识别蜂窝ROI。使用“ROI中的填充孔”和“将ROI添加到序列”块来完成二进制图像。该图像用作“活动轮廓”块的“绑定场到ROI”步骤的输入。
  3. 使不同的检测参数适应图像（见注11）。
  4. 使用块“添加ROI到序列”和“ROI统计”来测量这些单元格的不同特征（XY位置，大小，形状，等。）。
  图15.自动图像处理管道的第二部分。从细胞核到单细胞。
4. 从FITC或TRITC通道鉴定单个细菌以分别检测GFP-或dsRed- 沙门氏菌（图16）。
  1. 使用2“提取通道”块从图像系列中提取FITC和TRITC通道。
  2. 使用2个“小波点检测器”块来识别特定大小范围内的单个细菌。
  3. 使用2“添加ROI序列”和2“ROI统计”块来测量GFP-或dsRed- 沙门氏菌的不同特征（XY位置，大小，等。）。
  图16.自动图像处理管道的第三部分。从FITC或TRITC通道提取到细菌ROI的测量。
5. 通过组合来自细胞核，细胞和细菌的信息可以获得更多的细胞特征。 Icy提供了将Javascript代码集成到“Javascript”块内的管道的可能性，这使得能够以较不严格的方式操纵ROI。
  1. 使用我们管道中预先集成的代码的“Javascript”块来获取每个细胞的细菌数量和相邻细胞的数量（感染与否）。
  2. 块的输入是检测到的ROI的不同列表，这些ROI上的测量值，从“整数”块提取的图像序列的数量，以及从“文件”块提取的图像集文件的名称。
  3. 输出是单个电子表格（.txt），集成了对来自一个实验井的单个细胞进行的所有测量。
使用R代码统计分析细胞特征
1. 从Icy输出文件到最终的R数据集
  使用开源R软件计算和分析通过自动测量Icy获得的数据。灰色框中的所有行对应于用R语言编写的代码。这些行可以直接复制并粘贴到R软件中（R Core Team，2013）。
  ＆NBSP;以下部分描述了如何从使用Icy获得的输出文件中准备R数据集。表格的每一行对应一个单元格，后面称为“感兴趣的单元格”，每列对应一个测量变量的值。
  ＆NBSP;这样的数据集包含从一个实验井的图像分析中测量的所有变量，以及从原始变量获得的一些更精细的变量。
  ＆NBSP;以下步骤（a）描述了如何从使用Icy测量的变量加载数据。步骤（b）描述了如何过滤图像边界上的单元格。步骤（c）和（d）描述了如何将更详细的变量添加为数据集的新列。步骤（e）描述了如何选择用于建模的最终变量。步骤（f）描述了如何组合每个井的数据以创建将在建模中使用的最终数据集。
  1. 从Icy分析中加载一个.txt输出文件并检查变量的数量。
    
    ＃将工作目录更改为包含Icy输出文件的目录
    setwd（dir = “path / to / data_set /” ）
    
    ＃加载从一口井获得的数据集并将其存储在表p1中
    p1＆lt; - read.（ “.... txt “ ，header = TRUE < span style =“color：＃E53333; font-family：＆quot;”>，skip = 1，na.strings = c（“”））
    
    ＃检查每个单元格的测量变量（列数）（数字为45）
    ncol（p1）
  2. 添加更多要在模型中使用的变量，例如圆度的平方根，局部细胞密度和未感染的相邻细胞。然后，手动添加变量“延迟”，这不包括在冰冷输出中。
    
    ＃将新列添加到表p1：它们用于存储变量（圆度的平方根：“sqrt-circ”，100μm范围内的单元格数量给定单元格：“Cells_100_microns”，未感染的相邻单元格数：“neighbor_non_inf1”，第一次和第二次感染之间的延迟：“延迟”）
    p1＆lt; - cbind（p1， 0 ， 0 ， 0 ， 0 ）
    名称（p1）[> 46:49 ]＆lt; - c（”sqrt_circ“，”Cells_100_microns“，”neighbor_non_inf1“< / span>，“延迟”）
    
    ＃使用公式计算每个单元格的圆形度的平方根：sqrt（4 x单元格区域/单元格周长^ 2）。测量的单元区域存储在称为“内部”的变量中，单元周长存储在称为“轮廓”的变量中。结果存储在“sqrt_circ”列中。
    for（i in 1 ：nrow（p1））{
    ＆nbsp; p1 $ sqrt_circ [i]＆lt; - sqrt（ 4 * pi * p1 $ interior [i] /（p1 $ contour [i] * * 2））
    }
    
    ＃计算局部细胞密度，作为感兴趣细胞100μm附近的周围细胞数。结果存储在“Cells_100_microns”列中。
    for （i in 1 ：nrow（p1））{＃i是感兴趣的细胞的索引
    ＆nbsp; ＆NBSP; #set100μm到-1的细胞数：感兴趣的细胞在100微米附近
    ＆nbsp; ＆NBSP; p1 $ Cells_100_microns [i]＆lt; - -1
    ＆nbsp; ＆NBSP; #subselect来自同一图像的所有单元格并将数据存储在矩阵中
    ＆nbsp; ＆NBSP; t＆lt; - p1 [（p1 $ img == p1 $ img [i]），]
    ＆nbsp; ＆NBSP; for （j in 1 < / span> ：nrow（t））{＃j是同一图像中单元格的索引
    ＆nbsp; ＆NBSP;通过使用X和Y坐标，检查图像的每个单元格是否在距离感兴趣的单元格100μm（即 312.5像素的条件下）附近。
    ＆nbsp; ＆NBSP; ＆nbsp;＆nbsp; if （sqrt（（p1 $ X [i] - t $ X [j]）^ 2 +（p1 $ Y [i] - t $ Y [j]）^ 2 ）＆lt; 312.5 ）{
    ＆nbsp; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP;如果这是真的话，#add一个到柜台
    ＆nbsp; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; p1 $ Cells_100_microns [i]＆lt; - p1 $ Cells_100_microns [i] + 1
    ＆nbsp; ＆NBSP; ＆NBSP; }
    ＆nbsp; ＆NBSP; }
    }
    
    ＃计算未被感染的相邻单元格的数量：它是相邻单元格数量（存储在“旁观者”列中）与受感染邻居数量之间的差异单元格（存储在“neighborinf1”列中）。结果存储在“neighbor_non_inf1”列中。
    
    p1 $ neighbor_non_inf1＆lt; - as.numeric（as.character（p1 $ bystanders）） - as.numeric（as.character（p1 $ neighborinf1））
    
    ＃将变量“neighborinf1”转换为数值
    p1 $ neighborinf1＆lt; - as.numeric（as.character（p1 $ neighborinf1））
    
    ＃设置此实验的第一次和第二次感染之间的延迟（1小时1小时，2小时2小时3小时3小时）。结果存储在“延迟”列中。
    p1 $ delay＆lt; - 1＃如果这里的值是1
  3. 图像边界上的细胞呈现偏差，因为并非所有变量都可以准确地测量这些细胞。过滤它们。
    
    ###考虑到图像边界上的细胞以获取局部细胞密度后，将其从数据集中移除以减少偏差
    ＃使用dsRed表达细菌的估计（存储在第7列）：当感兴趣的细胞与之接触时，Icy中的javascript将此变量设置为“NA”图像的边界
    p1＆lt; - p1 [which（p1 [， 7 ]！= 'NA'），]
  4. 添加与感染关联的变量。使用在冰冷中获得的细菌数量的估计值，创建表示第一次感染强度和第二次感染强度的变量。
    
    ###添加指示第一次感染强度的变量（低强度：“low_first”，中间强度：“mid_first”，高强度：“high_first”）< / span>
    ＃加载包含函数mutate的包plyr，它可以通过组合现有列来创建新列
    require（“plyr”）（Wickham，2011）。
    
    ###估计单个细胞中细胞内细菌的数量
    ＃Icy输出包含FITC和TRITC通道中高强度像素的数量（分别为green_surface和red_surface）。将此变量除以对应于一个细菌的平均像素数。这里25个像素对应一个细菌。
    p1 $ green_est＆lt; - as.numeric（as.character（p1 $ green_surface））/ 25
    p1 $ red_est＆lt; - as.numeric（as.character（p1 $ red_surface））/ 25
    
    ＃如果估计的总GFP表达细菌的数量低于0.7，则将三个变量设置为0;这相当于原始图像上的噪点，而不是细菌。
    ＃如果估计的总GFP表达细菌数量介于0.7和2.5之间，则将变量“low_first”设置为1。
    ＃如果估计的总GFP表达细菌的数量在2.5到8.5之间，则将变量“mid_first”设置为1。
    ＃如果估计的总GFP表达细菌数量高于8.5，则将变量“high_first”设置为1。
    p1＆lt; - cbind（mutate（p1，low_first = as.numeric（p1 $ green_est＆gt; 0.7＆amp; p1 $ green_est＆lt; 2.5），mid_first = as。数字（p1 $ green_est＆gt; 2.5＆amp; p1 $ green_est＆lt; 8.5），high_first = as.numeric（p1 $ green_est＆gt; 8.5）））
    
    ###添加一个表明存在第二次感染的变量
    ＃如果估计的dsRed表达细菌总数高于0.7，则将变量“second_inf_bool”设置为1
    p1＆lt; - cbind（mutate（p1，second_inf_bool = as.numeric（p1 $ red_est＆gt; 0.7 ）））
    
    ###保存每口井的完整数据集
    保存（p1，“complete_p1.Rdata”）
  5. 该表现在包含50多个变量。选择要在模型中使用的变量（可以根据分析的目的进行调整）。在这里，我们只选择10个变量，如下所述：
    1. second_inf_bool：布尔变量，如果感兴趣的细胞含有来自第二波感染的细菌，则取值1，否则为0。
    2. low_first：布尔变量，如果第二次感染的细菌数在1和2之间，则取值1，否则为0。
    3. med_first：布尔变量，如果第二次感染的细菌数量在3到8之间，则取值1，否则为0。
    4. high_first：布尔变量，如果第二次感染的细菌数量为9或更多，则取值1，否则为0。
    5. cell_perim：连续变量，用于获取感兴趣的细胞周长的值。＆nbsp;
    6. sqrt_circularity：连续变量，取值为感兴趣的单元格圆度的平方根值。
    7. neighbor_inf1：离散变量，它取第一波感染期间感染的相邻单元格数量的值。
    8. neighbor_non_inf1：离散变量，它接受第一波感染期间未被感染的相邻单元格数量的值。
    9. Cells_100_microns：离散变量，其获取感兴趣的细胞的100μm内的细胞数量的值
    10. 延迟：分类变量，它取第一波和第二波感染之间的延迟值（以小时为单位）。
    ##选择并保存要在模型中使用的变量。
    p1＆lt; - cbind（p1 $ second_inf_bool，p1 $ low_first，p1 $ mid_first，p1 $ high_first，p1 $ contour，p1 $ sqrt_circ，p1 $ neighborinf1，p1 $ neighbor_non_inf1，p1 $ Cells_100_microns，p1 $ delay）
    
    ＃rename columns
    colnames（p1）＆lt; - c（“second_inf_bool”，“low_first”，“mid_first”，“high_first”，“cell_perim”，“sqrt_circ”，“neighborinf1” ，“neighbor_non_inf1”，“Cells_100_microns”，“延迟”）
    
    ＃将p1转换为数据框，R中的数据结构
    p1＆lt; - as.data.frame（p1）
    ＃将周长从像素转换为微米
    p1 $ cell_perim＆lt; - p1 $ cell_perim / 3.125
    
    ＃用所选变量保存数据集
    保存（p1，“subselect_p1.Rdata”）
  6. 将从单个孔中获取的数据集合并，以创建用于进一步分析的最终数据集。
    
    ###组合数据集
    ＃使用来自各个井的选定变量加载数据集（p1，p2，...，px）
    load（“subselect_p1.Rdata”）#load p1 dataset
    load（“subselect_p2.Rdata”）#load p2数据集
    
    load（“subselect_px.Rdata”）#load px dataset
    
    ＃创建最终数据集
    final_dataset＆lt; - rbind（p1，p2，...，px）
    
    ＃save the final dataset
    save（final_dataset，“final_dataset.Rdata”）
2. 可视化感染和未感染细胞中变量的分布
  构建比较感染和未感染细胞变量分布的图。这些图对应于我们发表的文章（Voznica et al。，2018）的图5A。在这里，我们使用受感染的相邻单元格的变量（“neighinf1”）作为示例，但该脚本适用于其他变量。
  1. 加载包含所有孔数据的完整数据集。
    
    ＃将工作目录更改为包含数据文件的文件夹
    setwd（dir = “path / to / data_file /”）
    
    ＃加载数据集并将其存入矩阵 G然后 R - 该名称表明感染是首先使用GFP（ G reen）细菌，然后然后 dsRed（ R）细菌。
    load（'final_dataset.Rdata'）#load数据集名为final_dataset
    GthenR＆lt; - final_dataset #Rename it to GthenR
  2. 将数据分成两组。第一组对应于第二次感染期间感染的细胞，称为“感染细胞”。第二组对应于第二次感染期间未感染的细胞，称为“非感染细胞”。
    
    ###准备一个载体，其中包含被感染细胞的感染相邻细胞数
    #deseselect感染细胞的所有数据
    Inf2＆lt; - as.data.frame（GthenR [GthenR $ second_inf_bool == 1 ，] ）
    
    ＃subselect有关受感染的相邻单元格的数据
    Inf2＆lt; - Inf2 $ neighborinf1
    Inf2＆lt; - unlist（Inf2）
    
    ＃过滤极值以进行绘图：这里我们用超过11个相邻单元格取出所有观察值，占数据集的不到1％。这个数字应该适用于每个变量。
    Inf2＆lt; - Inf2 [Inf2＆lt; 11 ]
    
    ###按照相同程序检测未感染细胞的感染相邻细胞数
    #seseselect未感染细胞的所有数据
    NonInf2＆lt; - as.data.frame（GthenR [GthenR $ second_inf_bool == 0 ，] ）
    
    ＃subselect有关受感染的相邻单元格的数据
    NonInf2＆lt; - NonInf2 $ neighborinf1
    NonInf2＆lt; - unlist（NonInf2）
    
    ＃过滤极值，用于绘图，与受感染的细胞类似。
    NonInf2＆lt; - NonInf2 [NonInf2＆lt; 11 ]
  3. 准备受感染和未感染细胞中受感染的邻近细胞分布的直方图。最终的图是密度图总和为100％。
    
    ＃使用受感染细胞的数据创建受感染的邻近细胞的第一个直方图;将此直方图存储在变量h_inei_inf
    中 h_inei_inf＆lt; - hist（Inf2，breaks = seq（ 0 ， 10 ，length.out = 12 ），freq = TRUE ）
    
    ＃使用来自未感染细胞的数据创建第二个直方图;将其存储在变量h_inei_noninf
    中 h_inei_noninf＆lt; - hist（NonInf2，breaks = seq（ 0 ， 10 ，length.out = 12 ），freq = TRUE ）
    
    ＃将两个直方图转换为密度图：将每个值的观测数除以观测总数
    h $ density = h $ counts / sum（h $ counts）* 100
    addin $ density = addin $ counts / sum（addin $ counts）* 100
    ＃列现在总和为100％
  4. 绘制分布图以获得类似于图17的图。
    
    ＃绘制感染细胞感染的邻近细胞的分布
    ＃属性“col”定义分布的颜色。这里受感染的细胞是红色的。 “col”的第四个参数定义颜色透明度。这里设置为50％，以便可以看到重叠的分布。
    plot（h，freq = FALSE，col = rgb（ 1 ， 0 ， 0 ， 0.5 ），main = “受感染的邻居分布”，xlab = “邻居数”，ylab = < span style =“color：＃E53333;”>“％cells”，ylim = c（ 0 ， 60 ））
    
    ＃添加未感染细胞的受感染相邻细胞的分布。这里未感染的细胞是蓝色的。
    plot（addin，freq = FALSE ，col = rgb（ 0 ， 0 ， 1 ， 0.5 ），add = TRUE ）
    
    ＃在图中添加图例
    图例（“topright”，inset = .05 ，c（“受感染的细胞”，“非感染细胞”），pch = c（ 22 ， 22 ），col = c（rgb（ 1 ， 0 ， 0 < / span>），rgb（ 0 ， 0 ， 1 ）），bty = ”n“，pt.bg = c（rgb（ 1 ， 0 ， 0 ），rgb（ 0 ， 0 ， 1 < / span>）））
    
    图17.感染细胞（红色）和未感染细胞（蓝色）感染相邻细胞数量分布的可视化
3. 测试细胞特征参与细胞易受沙门氏菌感染的影响
  为了测试不同细胞特征对细胞易受沙门氏菌感染的影响，建立一个训练有素的模型来预测感染细胞的特征，并测试其准确性（ ie >，可能性）这种模型。然后，测试缺少其中一个参数的新模型。通过减去两个模型之间的可能性，量化感染预测的改善，并总结所研究的细胞特征参与细胞脆弱性。这些量化对应于我们发表文章的图5B（Voznica et al。，2018）。
  1. 加载完整的数据集（参见注释12），并将2个变量转换为分类变量。
    
    ＃如有必要，重新加载数据集并将其存入矩阵GthenR（类似于步骤2.a）
    load（'final_dataset.Rdata'）#load数据集名为final_dataset
    GthenR＆lt; - final_dataset #Rename it to GthenR
    
    ＃convert second_inf_bool并延迟到分类变量，以便模型不解释其数值，但将其值视为对组的赋值
    GthenR $ second_inf_bool＆lt; - as.factor（GthenR $ second_inf_bool）
    GthenR $ delay＆lt; - as.factor（GthenR $ delay）
  2. 将数据划分为训练和测试数据集。创建两个包含数据分区索引的表。一个表用于训练数据集，其中包含总数据的9/10 th ，另一个用于包含总数据的1/10 th 的测试数据集。训练和测试数据集之间的数据重新分配是通过100种不同的切割完成的。
    
    ＃创建一个包含观察次数的变量
    observation_num＆lt; - nrow（GthenR）
    ＃创建一个包含用于训练模型的观察数量的变量
    train_num＆lt; - floor（observation_num * 0.9 ）
    ＃创建一个包含用于测试模型的观察数量的变量
    test_num＆lt; - observation_num - train_num
    
    ＃创建一个矩阵，其中包含100组构成训练集的各个观测指数（按行排列）
    samptrain＆lt; - matrix（nrow = 100，ncol = train_num）
    ＃创建一个矩阵，其中包含100组构成测试集的各个观测指数（按行排列）
    samptest＆lt; - matrix（nrow = 100，ncol = test_num）
    
    #data partitioning：用索引填充行以备将来数据分区
    for （i in 1 ： 100 ）{
    ＆nbsp; ＆NBSP; #create包含随机顺序的所有数据索引的向量
    ＆nbsp; ＆NBSP; indices_random＆lt; - sample（observation_num）
    ＆nbsp; ＆NBSP; #fill第一列训练集（“samptrain”）带有第一个“train_num”索引。它们用于创建第i个训练数据集
    ＆nbsp; ＆NBSP; samptrain [i，]＆lt; - indexes_random [ 1 ：train_num]
    ＆nbsp; ＆NBSP; #fill第i列测试集（“samptest”）与其余索引。它们用于创建第i个测试数据集
    ＆nbsp; ＆NBSP; samptest [i，]＆lt; - indexes_random [（train_num + 1 ）：length（indices_random）]
    ＆nbsp; ＆NBSP; }
    
    ＃save matrices
    write.（samptrain，“samptrain.txt”）
    write.（samptest，“samptest.txt”）
  3. 评估缺少其中一个变量的完整和部分模型的预测能力。
    
    ###评估模型预测
    ＃load package caret for modeling（Kuhn， et al。，2008）。
    require（“caret”）
    
    ＃创建一个存储对数似然估计（LL）的表
    LLall＆lt; - matrix（ 0 ，nrow = 8 ，ncol = 100 ）
    
    每个数据分区的＃，训练模型并使用对数似然法测试其预测能力
    for （t in 1 ： 100 ）{#data分区和对数似然估计设定数t < / span>
    ＆nbsp; #create training set
    ＆nbsp; GthenRtrain＆lt; - GthenR [samptrain [t，]，]
    ＆nbsp; #create测试集
    ＆nbsp; GthenRtest＆lt; - GthenR [samptest [t，]，]
    ＆nbsp; ###计算完整模型的对数似然估计，即包含所有变量
    ＆nbsp; #train训练集上的完整模型，名为GthenRtrain
    ＆nbsp; #precise模型是一个广义线性模型（method =“glm”），并且链接函数是一个逻辑的二项式变量second_inf_bool（family =预测二项式（link =“logit”）
    ＆nbsp; mod_fit＆lt; - train（second_inf_bool~。，data = GthenRtrain，method = “glm”，family =二项式（link = ”logit“））
    
    ＆nbsp; #predict第二次感染的概率（type =“prob”）给定测试集中的观察结果，称为GthenRtest
    ＆nbsp; model＆lt; - predict（mod_fit，newdata = GthenRtest，type = “prob”）
    
    ＆nbsp; #calculate对数模型的可能性估计。在该模型中，对数似然对应于观察到感染的细胞中感染的预测（对数）概率和未观察到感染的细胞中无感染的预测（对数）概率的总和。仅针对未用于模型培训的测试数据集计算此估计值。
    ＆nbsp; LL＆lt; - sum（（GthenRtest [，1] == 1 ）* log（model [， 2 ]））+总和（（GthenRtest [， 1 ] == 0 ）* log（model [， 1 ]））
    ＆nbsp; #save表中的对数似然估计
    ＆nbsp; LLall [ 2 ，t]＆lt; - LL
    
    ###计算部分模型缺少其中一个变量的对数似然性（“cell_perim”或“sqrt_circularity”或“neighbor_inf1”或“neighbor_non_inf1”或“Cells_100_microns”或“延迟“）
    ＆nbsp; for （ i 5 ： 10 ）{ < / span>
    ＆nbsp; ＆NBSP; #preparing training set
    ＆nbsp; ＆NBSP; GthenRtr＆lt; - GthenRtrain
    ＆nbsp; ＆NBSP; #deleting与省略变量对应的训练集的数据
    ＆nbsp; ＆NBSP; GthenRtr [，i]＆lt; - NULL
    
    ＆nbsp; ＆NBSP; #preparing测试集
    ＆nbsp; ＆NBSP; GthenRte＆lt; - GthenRtest
    ＆nbsp; ＆NBSP; #deleting对应于省略变量的测试集的数据
    ＆nbsp; ＆NBSP; GthenRte [，i]＆lt; - NULL
    
    ＆nbsp; ＆NBSP; #train训练数据集中的部分模型名为GthenRtr
    ＆nbsp; ＆NBSP; mod_fiti＆lt; - train（second_inf_bool~。，data = GthenRtr，method = “glm” ，family =二项式（link = ”logit“ ））
    ＆nbsp; ＆NBSP; #predict第二次感染的概率给出了测试集中的观察结果，称为GthenRte
    ＆nbsp; ＆NBSP; modelsi＆lt; - predict（mod_fiti，newdata = GthenRte，type = “prob” ）
    
    ＆nbsp; ＆NBSP; #calculate部分模型的对数似然性
    ＆nbsp; ＆NBSP; LL＆lt; - sum（（GthenRte [， 1 ] == 1 ）* log（modelsi [， 2 ]））+ sum（（ GthenRte [， 1 ] == 0 ）* log（modelsi [， < span style =“color：＃E53333; font-family：＆quot;”> 1 ]））
    
    ＆nbsp; ＆NBSP; #save对应的对数似然估计
    ＆nbsp; ＆NBSP; LLall [i - 2 ，t]＆lt; - LL
    ＆nbsp; }
    }
    
    ＆nbsp; ###评估最后一个部分模型的预测能力：该模型不包含有关第一次感染强度的信息（low_first，med_first，high_first）
    
    ＆nbsp; ＆NBSP; #prepare在矩阵中设置训练集GthenRtr_wo_i
    ＆nbsp; GthenRtr_wo_i＆lt; - GthenRtrain
    ＆nbsp; GthenRtr_wo_i [，c（ 2 ，3,4 ）]＆lt; - NULL #deleting low_first， med_first，high_first
    
    ＆nbsp; ＆NBSP; #prepare在矩阵中设置测试集GthenRte_wo_i
    ＆nbsp; GthenRte_wo_i＆lt; - GthenRtest
    ＆nbsp; GthenRte_wo_i [，c（ 2,3,4 ）]＆lt; - NULL #deleting low_first， med_first，high_first
    
    ＆nbsp; ＆NBSP; #train训练数据集中的部分模型名为GthenRtr_wo_i
    ＆nbsp; mod_fiti＆lt; - train（second_inf_bool~。，data = GthenRtr_wo_i，method = “glm” ，family =二项式（link = ”logit“ ））
    ＆nbsp; ＆NBSP; #predict第二次感染的概率给出了测试集中的观察结果，名为GthenRte_wo_i
    ＆nbsp; modelsii＆lt; - predict（mod_fiti，newdata = GthenRte_wo_i，type = “prob” ）
    
    ＆nbsp; #calculate日志似然估计
    ＆nbsp; LL_i＆lt; - sum（（GthenRte [， 1 ] == 1 ）* log（modelsii） [， 2 ]））+ sum（（ GthenRte [， 1 ] == 0 ）* log（modelsii [， < span style =“color：＃E53333; font-family：＆quot;”> 1 ]））
    ＆nbsp; #save日志似然估计
    ＆nbsp; LLall [ 2 ，t]＆lt; - LL_i
    }
    
    ＃保存包含对数似然估计值的表格
    write.（LLall， “LL_results.txt” ）
  4. 绘制使用GraphPad Prism获得的LL_results.txt文件中的数据（图18）
  5. 在完整模型和部分模型之间执行统计配对 t - 测试。
    
    图18.完整模型与部分模型的对数（似然）的比较，缺乏关于第一次感染强度的信息（****， P - 值＆lt; 0.0001）

笔记

菌落显示“红色”或“绿色”颜色。
管的倾斜度对于样品的通气是重要的。
记得要正确平衡离心机。
设计图周边的相邻孔应填充100μl温热DPBS，以提高每孔的重复性或感染（见图2）。
管的倾斜度对于样品充气很重要。＆nbsp;
不要涡旋任何含有沙门氏菌的管子，因为它会破坏鞭毛并大大降低感染效率。
孵育1小时后庆大霉素浓度的降低有助于防止庆大霉素掺入细胞中。
在获得之前，板可以在4℃下保持几天。
需要在实验之间调整的参数在块“HK-means”，“Active Contours”和“Wavelet Spot Detector”中。
每个块右上角的数字表示块在管道中执行的顺序。
“活动轮廓”块参数的正确校准决定了图像分析的成功。它们应该通过反复试验来适应。可以使用“显示”块来可视地跟踪分割过程。
仅当分析的步骤B2和B3（数据分析部分）未在原始数据上完成时，才需要重新加载数据集。

食谱

胎牛血清热灭活
1. 将血清等分到50ml标记的Falcon管中
2. 加热使水浴中的等分试样在56℃下灭活30分钟
3. 在室温下冷却并在-20°C下储存长达数周
沙门氏菌转化
1. 在250ml Erlenmeyer烧瓶中稀释500μl在50ml LB中的SL1344过夜培养物
2. 将培养基在培养箱的45°旋转架中于37°C与220转/分钟的轨道振荡器一起孵育3小时
3. 将传代培养物转移到冷的（4℃）50ml Falcon ®管中
4. 使用Centrifuge 5810/5810 R在4°C下以3,200 x g 离心10分钟
5. 弃去上清液，将沉淀重悬于20毫升冰冷的蒸馏水中
6. 重复步骤d和e
7. 弃去上清液，将沉淀重悬于100μl蒸馏水中
8. 加入2μlDNA（此处为pGG2或pM965质粒）
9. 将细菌与DNA一起转移到冷（4°C）电穿孔杯中
10. 在冰上孵育10分钟
11. 使用针对 E. coli 编程的Gene Pulser Electroporation Systems对细菌进行电穿孔（程序编号4）
12. 向比色杯中加入1毫升LB，将细菌转移到Eppendorf浴缸中
13. 在37℃的培养箱中用轨道振荡器以220rpm孵育1小时
14. 在培养皿中涂抹20μl培养物，该培养皿中含有与质粒上编码的抗性盒相对应的适当抗生素（此处为氨苄青霉素）
15. 在37°C孵育过夜
16. 选择单个菌落并在LB中补充适当的抗生素（此处为氨苄青霉素，100μg/ ml）过夜生长
17. 制作甘油原液并储存在-80°C
Lysogeny Broth（LB）培养基补充0.3 M NaCl（1 L）
1. 称重10克胰蛋白胨（BD）
2. 称重5克酵母提取物（BD）
3. 称重17.5克NaCl（Sigma-Aldrich）
4. 用蒸馏水调节至1升溶液
5. 将pH调节至7.4
6. 在120℃下高压灭菌20分钟
7. 在RT存储
LB琼脂（1升）
1. 称重10克胰蛋白胨（BD）
2. 称重5克酵母提取物（BD）
3. 称重5 g NaCl（Sigma-Aldrich）
4. 琼脂固化剂（BD）
5. 用蒸馏水调节至1升溶液
6. 将pH调节至7.4
7. 在120℃下高压灭菌20分钟
8. 在RT存储
含有氨苄青霉素的LB琼脂平板，浓度为100μg/ ml
1. 将LB琼脂在双锅炉中在700W的微波炉中熔化13分钟
2. 在室温下等待30分钟直至培养基冷却下来;加入100μg/ ml的氨苄青霉素，旋转LB琼脂溶液，确保氨苄青霉素混合均匀。
  注意：与未戴手套的手接触应该很舒服，但仍然相当热。
3. 将琼脂倒入圆形培养皿中
4. 让板在室温下放置过夜并在4℃下储存
EM介质20x（1 L）
1. 称重140.3 g NaCl（Sigma-Aldrich）
2. 称重10.4克KCl（赛默飞世尔科技）
3. 称重4 g CaCl 2 （Sigma-Aldrich）
4. 称重1.52克MgCl 2 （Sigma-Aldrich）
5. 称重18克葡萄糖（Sigma-Aldrich）
6. 称重119.1克HEPES（Sigma-Aldrich）
7. 用蒸馏水调节至1升溶液
8. 将pH调节至7.4
9. 在110℃下高压灭菌30分钟
10. 储存在4°C
EM medium 1x
对于1升EM培养基1x，在950ml蒸馏水中稀释50ml EM培养基20x

致谢

V.S.获得博士学位。巴黎狄德罗大学的奖学金由巴黎萨克莱大学的ENS Cachan分配;和FRM的赠款。 J.E.是LabEx联盟IBEID和MilieuInterieur的成员。 J.E.也承认ANR（授予StopBugEntry和AutoHostPath）和ERC（CoG EndoSubvert）的支持。
该方案最初在题为“通过定量图像分析和建模识别沙门氏菌感染期间宿主细胞脆弱性的参数”的文章中进行（Voznica 等人，，2018）。

利益争夺

作者没有利益冲突或竞争利益申报。

参考

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