材料和试剂

96孔黑色，平底，聚丙烯样品微孔板（Geiner Bio One，目录号：655209）
离心管50 ml，螺旋盖（Greiner Bio One International，目录号：227261）
微量离心管1.5ml（Eppendorf，目录号：0030120086）
Ni-NTA旋转柱（QIAGEN，目录号：31014）
电子。大肠杆菌 BL21（DE3）细胞（Merck，Novagen ®，目录号：69450-3）
pET32a质粒（Merck，Novagen ®，目录号：69015）
1 M IPTG（-20°C储存）（Thermo Fisher Scientific，目录号：R0392）
1 mg / ml DNase I（-20°C储存）（Sigma-Aldrich，目录号：DN25）
1 mg / ml RNase A（-20°C储存）（Thermo Fisher Scientific，目录号：EN0531）
10 mg / ml溶菌酶（溶于10 mM Tris-HCl，pH 8.0，-20°C保存）（Sigma-Aldrich，目录号：L6876）
100 mg / ml羧苄青霉素（-20°C储存）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：10177012）
1x PBS（从10x PBS稀释）（Vivantis，目录号：PB0344-1L）
2-吗啉代乙磺酸钠盐（MES Na）（默克，目录号：1.06197.0100）
溴酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：B8026）
牛血清白蛋白（BSA）（西格玛奥德里奇，目录号：A2153）
甘油（QRec，CAS：56-81-5）
生物素标记的组蛋白肽（生物素标记在合成过程中完成）（Mimotopes）溶于10％乙腈（50μg/μl）（Merck，目录号：100029）
咪唑（Sigma-Aldrich，目录号：I2399）
KCl（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
KH 2 PO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：P9791）
Na 2 HPO 4 （QRec，CAS：10028-24-7）
NaCl（默克，目录号：1.06404.0500）
NaCl *（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
*注意：替代品牌的NaCl用于食谱1-3; 5-7。
NaH 2 PO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：S3139）
NaOH（Fisher Scientific，目录号：S318）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：L3771）
Tris（Vivantis，目录号：PR0612）或Tris碱（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
胰蛋白胨（BD，目录号：211705）
Tween-20（西格玛奥德里奇，目录号：P1379）
酵母提取物（BD，目录号：288620）
β-巯基乙醇（储存在4°C）（Sigma-Aldrich，目录号：M6250）
LB液体培养基（见食谱）
磷酸盐缓冲盐水（10倍PBS）（见食谱）
裂解缓冲液（在室温下储存）（见食谱）
2x样品缓冲液（在室温下储存）（见食谱）
洗涤缓冲液（储存在4°C）（见食谱）
洗脱缓冲液（储存在4°C）（见食谱）
交换缓冲液（存储在4°C）（参见食谱）
MES分析缓冲液（见食谱）
PBS分析缓冲液（参见食谱）
TBS分析缓冲液（见食谱）

设备

生物传感器/链霉抗生物素蛋白（SA）托盘（PALL，FortéBio®，目录号：18-5019）＆nbsp;
FortéBIO® Octet RED96系统（PALL）
加热块（Bio Laboratories，Elite干浴培养箱）
高速冷冻离心机（TOMY DIGITAL BIOLOGY，型号：MX-305）
NanoDrop分光光度计（DeNovix，型号：DS-11）
PIPETMAN ®经典移液器P20，P200，P1000（Gilson，产品目录号：F123600，F123601，F123602）＆nbsp;
Pierce TM 蛋白质浓缩器10K MWCO（Thermo Fisher Scientific，目录号：88517）
振荡器培养箱（Eppendorf，New Brunswick TM ，型号：Innova ® 44培养箱振荡器，目录号：M1282-0002）
Sonifier（艾默生电气，型号：Branson超声波声波器® 450A）

软件

Octet RED96（v9.0）的数据采集软件购自PALLFortéBIO® Co.该软件可以安装在具有Windows 7（或更高版本）操作系统（OS）的其他计算机上进行数据分析。但是，该软件与MacIntosh OS不兼容。

程序

将目的蛋白质的编码序列克隆到pET32a质粒（Merck，Novagen ）中并转化到 E中。大肠杆菌BL21（DE3）细胞。

重组蛋白表达
1. 成长 E.将大肠杆菌BL21（DE3）细胞置于含有100μg/ ml羧苄青霉素的500ml LB培养基中，在摇床培养箱中于30℃过夜。
2. 用1 mM IPTG在30°C下诱导蛋白质表达4.5小时。
  注意：为验证蛋白质表达，取1 ml细胞培养物，以2,300 x g旋转1 min，收集细胞沉淀。加入100μl2x样品缓冲液，在95°C加热5分钟，制备蛋白质样品进行SDS-PAGE分析。
3. 通过在4℃下以9,000 x g 旋转2分钟将细胞沉淀物收集在50ml管中，并将细胞沉淀物储存在-80℃。
蛋白质提取和纯化
pET32a载体可在重组蛋白的N-或C-末端提供6x His-标签。下面，我们介绍了从 E中纯化6x His标记的重组蛋白。大肠杆菌 BL21（DE3）细胞裂解液使用Ni-NTA离心柱（QIAGEN），并从制造商的手册中进行了一些优化。
1. 将细胞沉淀在冰上解冻，并将细胞重悬于10ml（1/50至1/100细胞培养体积）的裂解缓冲液中。
  注意：在提取和纯化期间，将缓冲液，细胞悬液和蛋白质保持在0-4°C。＆nbsp;
2. 将细胞在冰上孵育30分钟，轻轻涡旋。
3. 使用两次30秒的爆发在400 W下进行声波处理，在爆发之间进行2分钟冷却。
4. 在4℃下以9,000 x g 离心30分钟以沉淀细胞碎片。将上清液转移到新的50毫升管中。
  注意：如果上清液含糊，请重复此步骤一次。
5. 通过用600μl裂解缓冲液平衡柱子来制备Ni-NTA柱用于纯化。在盖子打开的情况下，在890 x g ，4℃下离心2分钟。
6. 将含有重组蛋白的可溶性级分的上清液转移到Ni-NTA柱中进行纯化。每次最多可加载600μl裂解液。在270℃下离心5分钟，4℃。丢弃流过物（可溶性His-标记的蛋白质现在将与Ni-NTA柱结合）。
  注意：取20μl裂解液进行SDS-PAGE分析。加入20μl2x样品缓冲液，在95°C加热5分钟，然后在-20°C下保存。
7. 用洗涤缓冲液洗涤柱两次。在890 x g ，4℃下离心2分钟。
8. 用300μl洗脱缓冲液洗脱6次带His标签的蛋白质两次。通过在890 x g 离心2分钟，4℃收集洗脱液（洗脱的目标蛋白质）。
9. 对剩余的裂解物重复步骤B5-B8。巩固洗脱液用于下一步骤（步骤B10）。
10. 将洗脱液（目标蛋白质）加载到Pierce Protein Concentrator（10K MWCO）的顶部腔室中以更换洗脱缓冲液并浓缩蛋白质。＆nbsp;
11. 立即用交换缓冲液将洗脱液（目标蛋白质）加满至5ml。在9,000 x g ，4℃下离心直至样品体积小于500μl。移除并丢弃底部收集室中的流通物。重复此步骤至少5次，以确保最终的咪唑浓度低于0.1 mM。
  注意：交换缓冲液的pH值由重组蛋白的等电点决定。
12. 用移液管轻轻吸出顶部腔室内的浓缩蛋白质。将浓缩的蛋白质转移到微量离心管中。用NanoDrop评估蛋白质浓度。
13. 用交换缓冲液将蛋白质稀释至100μM，并储存在-80°C。
  注意：为确认蛋白质完整性，取20μl重组蛋白进行SDS-PAGE分析。加入20μl2x样品缓冲液，在95°C加热5分钟，然后在-20°C下保存。
生物层干涉测定结合试验
我们在FortéBIO® Octet RED96仪器（PALL）上进行了生物层干涉测量结合。
1. 提前打开仪器至少15至20分钟以预热灯泡。将工作温度设置为30°C，以预热样品板支架（图1）。
  
  图1. Octet RED96机器。打开电源以预热Octet RED96机器。当蓝色指示灯如图所示点亮时，设备即可使用。
2. 准备分析缓冲区
  注意：需要进行缓冲液测试以确定每种蛋白质的适当分析缓冲液。
3. 在室温下将测定缓冲液中的链霉抗生物素蛋白传感器预润湿至少10分钟，以去除传感器上的蔗糖涂层（图2）。
  
  图2.传感器的准备。将绿色传感器支架从板支架上取下（蓝色），然后在板孔（黑色）（A）中加入测定缓冲液（每孔250μl）。最后，将绿色传感器支架（带传感器尖端）安装到板支架（B）上。应注意不要触摸传感器尖端。确认传感器吸头浸没在测定缓冲液中并预先润湿。
4. 使用实验向导选项卡在Octet数据采集软件（v9.0，PALL）中设置实验设计（图3）。标签菜单包括：
  
  图3.在Octet数据采集软件中启动实验设计。在Octet数据采集软件窗口中，选择“新动力学实验”（“基本动力学”选项），如图所示。在可用的模板下，如果使用链霉抗生物素蛋白生物传感器，选择'生物分子动力学 - SA生物传感器'下的'Kinetic Characterization_8CH_96W.fmf'。单击绿色箭头按钮进入程序。
  1. 板定义（图4）。分配每个柱的内容，包括缓冲液，生物素标记的组蛋白肽和待测结合蛋白。输入每个孔中结合蛋白的浓度。此外，具有分析缓冲液的参考孔只需要包含在同一列中。
    
    图4.板定义。选择样品板布局上的孔。右键单击每列以分配板布局中每个孔的内容（左上角），'B'：缓冲区，'L'：加载，'粉圆圈'表示样品所在的位置。在右侧表格中输入其他标识符信息（例如，缓冲区组合）。
  2. 分析定义（图5）。通常，在2个物体之间的结合动力学测定中包括5个步骤：基线1，加载;基线2，关联和解除关联。为了产生稳定的初始信号，在基线1步骤中，需要将传感器浸泡在测定缓冲液中至少120秒。加载步骤将生物素标记的组蛋白肽固定在传感器上。阈值函数可用于设置加载到传感器上的肽的量。然后将传感器再次分配到测定缓冲液至少120秒，以在关联步骤之前建立另一个稳定的基线信号（基线2）。在结合步骤期间，将具有固定化肽的传感器分配给含有不同浓度的目的蛋白质的孔。调整关联步骤的时间，使蛋白质浓度最高的孔达到平衡结合信号。最后，再次将传感器分配给Assay缓冲液，以便解除5分钟的分离。
    
    图5.分析定义。将“步骤数据列表”中“步骤名称”下的下拉菜单中的每个特定步骤分配到平板分析中的每个色谱柱。 A.基线步骤和孔的分配。在“步骤数据列表”中选择“基线”，然后双击第一列。 B.装载步骤和孔的分配。选择“步骤数据列表”下的“加载”，然后双击第二列孔。 C.第二基线步骤和孔的分配。在“步骤数据列表”中选择“基线”，然后选择“基线2”，然后双击第三列孔。 D.关联步骤和孔的分配。从“步骤数据列表”中选择“关联”，然后双击第四列孔。 E.解离步骤和孔的分配。从“步骤数据列表”中选择“解离”，然后双击第三列孔，如上所示。通过从'Assay Steps List'中选择'Sensor Type'，可以根据固定配体的标签更改传感器类型。
  3. 传感器分配。选择传感器托盘上预湿传感器的位置（图6）。
    
    图6.预湿传感器位置的分配。根据传感器托盘上传感器的位置选择传感器（紫色方块，左上角）。
  4. 回顾实验（图7）。
    
    图7.实验回顾。模拟传感器（正方形）移动到测定板上的预定位置。左侧的正方形表示传感器的起始位置。传感器从对接位置（正方形，左上角）到不同位置的移动在A-E中示出：A。基线确定。 B.肽的加载。 C.基线2的确定。 D.（肽与靶蛋白的关联）。 E.解离（来自肽的蛋白质）。 F.程序结束。红色星号，表示程序进度的级别位置;蓝色箭头，样品板上传感器的位置（A-E，右上角）。左下角的窗口显示正在执行的确切步骤，该步骤也在右下角放大。
5. 用分析缓冲液将生物素标记的组蛋白肽（Mimotope，Australia）稀释至5μg/ ml，并将250μl每种肽加入相应的孔中。
6. 用分析缓冲液制备纯化的重组蛋白的连续稀释液，并将250μl蛋白质溶液转移到与步骤C3中的设计相对应的每个孔中。
7. 小心地将传感器托盘放在传感器平台上（机器左侧），将样品托盘放在右侧的板托架上。确保两个托盘的方向正确并稳定设置（图8）。
  
  图8. Octet RED96中传感器托盘和样品盘的布置。传感器托盘位于左侧，而样品托盘位于右侧。关闭Octet RED96机器的门。
8. 开始测定（图9）。点击“开始”开始分析。
  
  图9.描述测定和运行设置属性的窗口。分析从“开始”（左）开始。请注意，机器上的橙色指示灯将亮起（活动模式）（右）。

数据分析

在该协议中，我们在Octet数据分析软件（v9.0，PALL）中演示了数据分析。

测定完成后，打开Octet数据分析软件并加载实验文件夹。
在“处理”选项卡中进行数据处理。这通常包括5个步骤：
1. 在“数据选择”框中，单击“传感器选择”以分配参考孔（图10）。
2. 勾选“减法”框，从原始蛋白质 - 肽相互作用数据中减去参考数据（图11）。
3. 勾选“对齐Y轴”框以将所有样本的数据对齐到Y = 0.选择“基线”并选择基线水平的时间范围。该时间范围需要处于基线信号稳定的阶段，通常是从基线1步的最后10秒开始（图11）。
4. 勾选“步进间校正”并选择与“关联”对齐。此步骤减少了关联和解离步骤之间的信号转换。
5. 选择“Savitzky-Golay过滤”功能并启动数据处理。
  
  图10.来自BLI测定的原始数据的截屏。 X轴表示实验的时间线。 Y轴显示每个时间点的信号偏移。红色垂直线表示实验的5个不同步骤的转变点：基线1，加载，基线2，关联和解离。
  
  图11. BLI数据流程的屏幕截图。“减法”框和参考孔以方框表示。参考孔具有关联孔（H11），在测定缓冲液中没有蛋白质。
数据处理后，进一步分析处理后的数据，并在“分析”选项卡中获得解离常数（K D ）。
1. 在“分析步骤”框中，选择“关联和分离”和模型1：1。
2. 在“拟合”框中，选择按颜色分组的全局拟合，并通过传感器取消链接R max （图12）。单击“拟合曲线”按钮开始拟合。使用非线性回归拟合来分析数据并得出解离常数（K D ）。数据拟合的优度通过R 2 和χ 2 值验证。
  
  图12.已处理的BLI数据。左上角，原始数据;右上角，参考井减法后的数据;左下方，将Y轴与基线对齐后的数据;右下角，将X轴与关联步骤对齐后的数据。
对于结果查看，拟合曲线可以以不同方式分组。例如，在图13中，我们通过加载样品ID对图形进行分组，以便具有相同加载样品ID（相同肽名称）的曲线将包含在同一图表中。

图13.数据分析表面的屏幕截图。根据加载样本ID对数据进行排序的图表示例。
保存并导出数据文件。定量结果，包括K D 值，R 2 和χ 2 可以在Excel报告的“结果表”工作表中找到。

笔记

问题：重组蛋白不能稳定表达
解决方案：某些蛋白质在表达过程中很容易降解。可以进行一些优化以最小化表达期间的蛋白质降解。
1. 将IPTG浓度降至0.5 mM（Larentis et al。，2014）。
2. 在较长的诱导时间（24小时-32小时）内，在较低的温度范围（16°C至26°C）下进行蛋白质表达（de Groot和Ventura，2006; San-Miguel 等。，2013）。
3. 将增长媒体改为Terrific Broth（Tartof和Hobbs，1987）。
4. 预冷却缓冲液并将工作温度保持在0°C至4°C，因为这有助于最大限度地减少蛋白质提取和纯化过程中的降解。
5. 超声处理步骤后，将蛋白酶抑制剂片剂（Complete TM ，Mini，无EDTA蛋白酶抑制剂，Roche）加入细胞裂解液中。
问题：纯化蛋白中的其他条带
溶液：蛋白质纯化后，取5μl蛋白质，与2x样品缓冲液混合，在95°C变性，并使用SDS-PAGE凝胶检查纯度。如果使用考马斯蓝染色可以观察到其他条带，可以进一步改变以去除非特异性结合的蛋白质。
1. 在洗涤缓冲液中将咪唑浓度增加至20-50mM（Crowe 等人，1996; Bornhorst和Falke，2000）。
2. 将0.1％NP-40加入洗涤缓冲液中。
3. 如果非特异性条带与靶蛋白质相比尺寸较小，则对蛋白质浓缩器使用较大的MWCO（> 10K）（分子量截止值）。
4. 使用凝胶色谱进行纯化。
问题：蛋白质在分析缓冲液中显示高背景结合
解决方案：检测缓冲液优化是BLI检测前所需的关键步骤。需要最小化蛋白质和传感器之间的非特异性相互作用（不固定生物素化的肽）。下面是几个可以测试的缓冲区（参见食谱部分）：
1. 20mM Tris pH 8.0,200mM NaCl
2. 20mM Tris pH 8.0,200mM NaCl，0.1％BSA，0.1％Tween-20
3. TBS分析缓冲液（见食谱）
4. PBS分析缓冲液（参见食谱）
5. MES分析缓冲液（见食谱）
对于每种感兴趣的蛋白质，给出最低水平的背景结合的最佳测定缓冲液可以是不同的。因此，需要对每种蛋白质进行缓冲液优化。图14显示了在与组蛋白肽进行相互作用测试之前对Swi6蛋白进行的缓冲液测试。 Swi6显示出对缓冲液A中的传感器的高度非特异性结合。加入0.1％BSA和0.1％吐温-20后，非特异性结合最小化。关于参考孔F（没有Swi6蛋白），缓冲液D显示最低的非特异性结合。因此，该缓冲液用于Swi6的BLI测定（Ren et al。，2018）。

图14.缓冲区测试的结果。 X轴表示实验的时间轴。 Y轴显示每个时间点的信号偏移。红色垂直线表示实验的4个不同步骤的转变点：基线，加载，关联和解离。在加载孔中不添加肽。缓冲区A至E的组成部分在文中说明。 F，参考载满H 2 O。

当测试蛋白质的浓度太高时，也可以观察到非特异性结合。浓度筛选可用于确定用于测定的蛋白质的最佳浓度，而不显示与未加载的传感器的背景相互作用。对于每种蛋白质，BLI测定的最佳蛋白质浓度是可变的。但是，建议使用较低浓度的蛋白质，以尽量减少样品基质中的非特异性结合信号。

食谱

LB培养基（1升）
10克胰蛋白胨
10克NaCl *
5克酵母提取物
调节至pH 7.0，高压灭菌
磷酸盐缓冲盐水（10x PBS，1 L）
80克NaCl *
2克KCl
14.4g Na 2 HPO 4
2.4 g KH 2 PO 4
将pH调节至7.4并进行高压灭菌或过滤灭菌
对于1x PBS，用900ml去离子H 2 O稀释100ml 10x PBS并高压灭菌或过滤灭菌
裂解缓冲液
50mM NaH 2 PO 4
300 mM NaCl *
10 mM咪唑
用NaOH调节pH至8.0;过滤器消毒并在室温下储存
预冷至4°C并在使用前加入溶菌酶（1 mg / ml），DNase I（5μg/ ml）和RNase A（10μg/ ml）
2x样品缓冲液
62.5mM Tris-HCl pH 6.8
25％（v / v）甘油
2％（w / v）SDS
0.01％（w / v）溴酚蓝
在室温下储存
使用前加入1/20（v / v）的β-巯基乙醇
洗涤缓冲液
50mM NaH 2 PO 4
300 mM NaCl *
20 mM咪唑
调节至pH 8.0
过滤器消毒，储存和使用温度为4°C
洗脱缓冲液
50mM NaH 2 PO 4
300 mM NaCl *
500 mM咪唑
过滤器消毒，储存和使用温度为4°C
交换缓冲区
200 mM NaCl *
50 mM Tris-HCl
用HCl调节pH至7.5 过滤器消毒，储存和使用温度为4°C
MES分析缓冲液（pH 6.0）
20mM 2-吗啉代乙磺酸钠盐（MES Na）
200 mM NaCl
调节至pH 6.0
0.1％BSA
0.1％Tween-20
过滤器消毒，储存和使用温度为4°C
PBS分析缓冲液（pH 7.4）
1x PBS（从10x PBS Vivantis稀释）
注意：1x PBS溶液含有137 mM NaCl，2.7 mM KCl和10 mM磷酸盐。
0.1％BSA
0.1％Tween-20
过滤器消毒，储存和使用温度为4°C
TBS分析缓冲液（pH 8.5）
20 mM Tris
200 mM NaCl
调节至pH 8.5
0.1％BSA
0.1％Tween-20
过滤器消毒，储存和使用温度为4°C

致谢

这项工作得到了新加坡教育部一级资助（参考：R-183-000-389-112）的支持，授予E.S.C.我们感谢丽贝卡杰克逊对这份手稿进行批判性编辑。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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