材料和试剂

经认证的Sani芯片，与老鼠的笼式床上用品材料相同（Envigo，Harlan，Teklad，目录号：7090C）
聚乙烯管，PE-50（科学产品，目录号：BB31695-PE / 1）
工业级粘合剂（SP Scienceware - Bel-Art Products - H-B Instrument，目录号：24006-0000）
砂磨片（3M TM Wetordry TM 磨料片，氧化铝，P400级）（3M，目录号：213Q）
纸巾
编号索引卡，用于识别盲目评分的动物
美纹纸胶带
永久性标记
大鼠（Sprague-Dawley）
蒸馏水
10％乙醇

设备

带塑料隔离盖的塑料“鞋盒”鼠笼（我们的尺寸为42厘米x 20厘米x 20厘米，与我们的家用笼相同; 例如，Allentown，目录号：PC10198）
非绝缘铜线，1 mm直径（Fisher Scientific，目录号：15-545-1B）
制造商：Arcor Electronics，目录号：BARE18GA。
玻璃搅拌棒，直径5 mm x 200 mm（Fisher Scientific，目录号：S63449）
环形支架（EISCO，目录号：CH0653E1RD4）
三爪延伸夹（Fisher Scientific，目录号：05-769-7Q），附在环形支架上
鳄鱼夹（EISCO，目录号：PH1053B），切割和焊接，一个到冲击发生器的冲击输出电缆的每个引线
非绝缘线包冲击探针（定制加工，见程序步骤A1）
改进的测试笼和盖子（定制，参见程序步骤A2）
电钻
工具刀
剪线钳
冲击发生器（例如，Coulbourn Instruments，型号：H13-15）
录影机
鼎
电脑
计时器

软件

视频录制软件，例如，QuickTime（Apple）
统计分析软件，例如，Statistica（TIBCO Software）

程序

制作定制设备
1. 非绝缘线绕探针
  1. 每个玻璃搅拌棒切割两段铜线和两段聚乙烯管，每根长约1米。
  2. 在玻璃搅拌棒末端附近以一定角度胶一条铜线末端约1厘米，这样一旦胶水干燥，铜线的其余部分就可以绕搅拌棒的长度盘绕（见图1）。
    
    图1.制作绕线探针。 A.四个交替的铜线和聚乙烯管段以一定角度粘在玻璃搅拌棒的末端。 B.导线绕杆缠绕至15厘米标记，管道将两根铜线分开。 C.铜线的段从杆延伸，使得它们可以连接到具有鳄鱼夹的冲击发生器的双极插座。
  3. 将聚乙烯管段末端1厘米粘到棒上，与电线相邻;将第二段铜线粘在管道附近，并将第二段管道粘到第二段铜线上。让胶水完全干燥。
  4. 将每根电线和一根管子平行缠绕并紧密相邻，交替的电线/管子/电线/管子，约15厘米的杆子，留下最后5厘米的杆裸露（标记杆上的15厘米点））。每厘米缠绕5圈。当老鼠接触探头时，在两根非绝缘线之间闭合电路时，将发出电击。管沿着杆的长度夹在两根导线之间，以确保导线不会彼此接触并使电路短路。在缠绕电线时仔细检查电线，确保两根铜线不会相互接触。
  5. 在玻璃棒上15厘米处再次粘上四段。干燥后，将管道末端夹紧在探头上。夹住铜线的末端，使每个~5厘米从15厘米标记突出;这些端部应朝向相反方向（确保两根导线之间不接触），并将作为将探头连接到冲击发生器的鳄鱼夹的接触点。
  6. 再次，仔细检查探头，确保铜线沿着探头的整个长度被管道隔开。用砂纸去除探头末端的任何多余的胶水（老鼠接触的地方）。您可以通过将探头连接到冲击发生器来测试探头是否短路（参见程序步骤B9）。
2. 改装测试笼和盖子
  1. 从塑料测试笼周围几个点的底部测量5厘米，并用永久性标记标记。使用直边在5厘米标记处的测试笼外侧创建一条虚线，并在添加新的床上用品时将其用作“填充线”（参见图2）。
    
    图2.改进的测试笼和盖子。 A.在笼子底部5厘米处围绕笼子绘制“填充线”。 B.在笼子的短端钻一个直径为2厘米的孔，中心距离底部7厘米，用于插入冲击探针。 C.从盖子中心取出塑料，以便在测试过程中可视化并接近笼中的老鼠。
  2. 在塑料保持架的短端，标记距离保持架底部7厘米并水平居中的点。此时钻一个直径为2厘米的孔，这是将探头插入保持架的位置。将孔的内边缘打磨成光滑的。
  3. 从笼盖上取下织物屏障，并切掉覆盖盖子中心的任何塑料肋或薄片。保持盖子的周边完好无损，因为这样可以防止老鼠在测试过程中试图跳出笼子。您希望能够在不取下盖子的情况下将老鼠放入笼子中，并且能够在盖子就位时从安装在笼子正上方的摄像机中清楚地看到笼子的所有部分。将盖子上任何切割塑料的边缘打磨成光滑的。如果动物没有像我们的那样在任何线棒盖上安装屏障盖，我们不建议修改线棒盖进行测试，而是建议购买材料清单中提到的屏障盖。需要额外的工具才能在线条上切出一个洞并使切割边缘光滑，除非它被抬起，否则动物将能够从修改后的线棒盖中爬出来。
设置和测试设备
1. 设置如图3A所示的设备
  1. 将测试笼放在安装在三脚架上的摄像机下方的地板上（提供测试笼的完整视图）。用胶带或标记标记笼子在地板上的位置，以确保笼子放置一致。在定位笼子和三脚架时，重要的是避免影响大鼠行为的阴影或亮点，或者在评分时干扰清晰的视力。
  2. 在地板上放置一个环形支架，以便可以将一个防震探针夹在其上并插入测试笼短边上的2厘米孔中。另外，用胶带标记环形支架在地板上的位置。
  3. 在环形支架后面放置一个隔板或窗帘，以阻止老鼠在测试过程中对实验者的看法。
  4. 在分区后面创建实验者工作站，包括一个包含计算机的桌面，该计算机带有连接到三脚架摄像机的视频录制软件（例如，QuickTime），以及可以连接的实验者可触及的震动发生器夹紧在环形支架上时的震动探头。
2. 打开三脚架式摄像机，计算机和震动发生器。
3. 在视频录制程序中打开一个新录制（例如，对于QuickTime：打开QuickTime。选择“文件”→“新电影”）。
4. 确保摄像机已连接到计算机，视频录制软件检测到馈送，并且当将笼放在摄像机下方时，视野包含测试笼的整个俯视图。此外，确保视频录制的目标文件夹具有足够的内存空间用于新录制。
5. 在测试笼内填充5厘米的新Sani芯片寝具和位置笼（带盖），在相机下方的地板上，借助于地板标记，确保放置一致。
6. 用细砂纸轻轻刷洗探头上的导线表面，然后用干纸巾擦拭。这样可以去除任何可能随着时间的推移涂覆导线并在与探针接触时损害冲击传递的生物膜，并且还可以去除任何可能使两根导线之间的电路短路的碎片。
7. 夹住杆的无线端并将其连接到环形支架上。将环形支架移动到位，将探头插入测试笼末端2 cm的孔中。探头应位于5厘米深的Sani芯片垫层材料表面上方2厘米处，并应伸入测试笼中6厘米处。
8. 将一个鳄鱼夹夹在一根非绝缘铜线上，将另一个鳄鱼夹夹在另一段非绝缘铜线上，将冲击发生器的2极输出连接到探头上（见图3B和3C）。
  
  图3.测试区域。 A.设备设置：（1）三脚架和摄像机; （2）笼子; （3）环形支架; （4）分区; （5）冲击发生器; （6）电脑; B.将笼子置于摄像机下，将震动探头连接到冲击发生器，夹紧到环形支架，并插入测试笼中。 C.探头的特写镜头夹在环形支架上，附有鳄鱼夹。
9. 设置冲击发生器以提供2 mA电流（见图4A和4B）
  
  图4.冲击发生器和操作。 A.冲击发生器：（1）POWER指示灯（电源接通时灯泡点亮，冲击发生器背面电源开关）; （2）OPERATE面板带有切换功能，可在“REMOTE”操作和“MANUAL”操作之间进行选择（此测试使用手动操作，实验者必须按住切换按钮）; （3）METER RANGE面板，带有切换功能，可在“低”和“高”毫安设置之间进行选择，分别对应于毫安表上的顶部和底部刻度（对于此协议，必须设置为“高”以实现设定为2mA）; （4）带“SET SHOCK”旋钮的手动面板，可拨打调节冲击设定; （5）SHOCK ROUTING面板带有切换功能，可在设置时手动设置冲击输出时使用的“SET / TEST”和“SUBJECT”之间进行选择，用于测试探头是否短路以及在进行时对主体施加冲击时冲击探测防御掩埋试验; （6）毫安表，当METER RANGE设置为“HIGH”时，较低的刻度表示毫安读数; B.设置冲击发生器以提供2 mA电流。当SHOCK ROUTING切换设置为“SET / TEST”并且METER RANGE切换设置为“HIGH”时，实验者按住OPERATE切换到“MANUAL”并拨打MANUAL面板上的“SET SHOCK”旋钮，直到毫安表上的针读数为2 mA，描述。当OPERATE切换翻转为“MANUAL”时，SHOCK ROUTING面板上相应的灯泡将亮起。
  1. 翻转“METER RANGE”切换到“HIGH”。
  2. 翻转“SHOCK ROUTING”切换到“SET / TEST”。
  3. 按住“MANUAL”，在“MANUAL”面板上的“SET SHOCK”旋钮上切换“MANUAL”，直到仪表读数为2 mA。手动检查当前读数，确保通过将“SHOCK ROUTING”切换到“SUBJECT”并按住“OPERATE”切换来避免电路短路。目前的读数应该是＆lt;测试前设置时为0.2 mA。如果更高，请取下探头并用砂纸和干纸巾再次清洁，目视检查探头是否短路（导线之间的接触）。如果手动电流读数仍然很高，请切换到另一个探头，用蒸馏水清洁第一个探头并用纸巾擦干。在再次使用之前，让第一个探头彻底风干。
10. 将受试者（在家庭笼子中）带入测试室，让他们适应测试室60分钟（见注1）。在我们的实验中，大鼠是成年Sprague-Dawley大鼠，在12小时/ 12小时光/暗循环中饲养，并在白光照明期间进行测试。我们从未在黑暗（熄灯）阶段对动物进行过测试，但预计在此期间的测试可能会增加测试中动物的整体运动活动，一些报告显示在黑暗与光照下测试的大鼠埋藏增加（De Boer et al。，1991; Pinel et al。，1994）。在进行行为测试之前，将动物单独圈养并定期处理至少两周，在此期间他们接受慢性压力或控制处理治疗。
进行防震探测防御掩埋试验
1. 开始视频录制（QuickTime中的“录制”）并将编号的盲卡短暂放在相机下以识别测试对象。保持单独记录实验条件对应的卡号，以便在视频评分后打破盲人。
2. 将大鼠轻轻放入测试笼的远端（盖子打开），背对探头（见图5）。
  
  图5.进行防震探测防御掩埋测试。 A.测试前，相机会显示盲识别卡。 B.将大鼠放置在与探针相对的笼子的末端，背对探针。 C.大鼠接近探针并受到电击。 D.退出休克后，电流关闭，15分钟的评分期开始，在此期间，大鼠可能表现出不动，取代寝具，即，埋葬或从事“其他”行为，例如，探索，修饰，等，没有得分（见图6）。
3. 按下冲击发生器上的“手动”开关，直到鼠标接近探头并接触。
4. 在大鼠受到震动并且明显反应并从探针中退出后，释放切换并启动15分钟计时器。有时老鼠会在退出前快速连续两次受到惊吓。如果不清楚大鼠是否感到震惊，让大鼠继续探测探针直到明显震惊（见注2）。
5. 在记录大鼠对休克的行为反应15分钟后，停止记录，保存视频，并将大鼠返回其家笼（见注3）。
6. 在受试者之间，更换测试笼中的垫层并清洁冲击探针（从程序的步骤B5开始重新开始）。
7. 在测试阶段结束时，处理用过的床上用品，清洁冲击探针，并用蒸馏水和10％乙醇擦拭空的试验笼。
视频录制中的评分行为
1. 盲目实验条件的实验者将对录制的视频进行评分。
2. 在评分时，记下视频上的时间戳，该时间戳对应于大鼠何时明显地对来自探头的震动作出反应。然后，在此时间点开始的视频的15分钟期间对行为进行评分。
3. 在初始休克后15分钟内从探针中取出的相关测量值（见图6）包括：a）大鼠在测试笼的远端半部分中不能移动的时间，远离震动探针。我们将不动性定义为床上用品上的所有4个爪子，仅显示与呼吸相关的轻微运动，轻微的姿势变化，耳朵抽搐，嗅闻和头部的轻微扫描运动。修饰不是不动的。转动躯干或抬起肢体不是不动的; b）大鼠埋葬的时间，其定义为被褥材料的任何位移，包括挖洞，轻弹，推，犁或踢床上用品。开始埋葬的延迟是可以记录的另一个措施（从第一次埋葬活动到冲击时间）。
  
  图6.在15分钟测试期间显示的不同行为的代表性图像。 A.不动性; B.埋葬 - 大鼠用前爪将垫料推向探头。 C.钻入床上用品（刻划为埋葬）。这通常伴随着向探头轻弹或推动垫层。 D.探索行为（未评分）; E.探测附近的不动性（未评分）; F.参加探测时的不动性（未评分）。虚线表示测试区域的中线，作为可以对不动性进行评分的截止值（即，在远离探头的测试区域内）。

数据分析

在受试者之间比较不动时间（以秒为单位）和埋藏时间（以秒为单位），通常通过ANOVA确定相互作用和主效应（例如，压力或治疗干预）和成对比较的合适测试，例如，Newman-Keuls测试。不动性和埋葬的变化分别被解释为被动和主动应对的变化，并且两种测量中的增加或减少被解释为总体行为反应性的增加或减少。
当新的研究者开始使用该测试时，通过对新研究者和经验丰富的研究者对相同视频进行评分所产生的不动性和掩埋分数进行相关性分析来评估评估者之间的可靠性。相关系数>新研究者需要0.95独立开始进行冲击探测防御掩埋测试。
埋置率用作优选响应的比例量度，埋置率高于0.5表示偏好活动应对，埋置率低于0.5表示偏好被动应对，埋置率等于0.5表示无偏好。埋藏率（但见注4）计算如下：

因此，群体之间的埋藏率变化可以揭示应对方式的变化。例如，与无应激对照大鼠相比，我们通常看到慢性应激大鼠从主动应变到被动应对。类似于不动时间和埋藏时间，通常通过ANOVA和例如，Newman-Keuls测试进行成对比较来分析埋葬比率。
埋藏延迟（以秒为单位）和桩高（以厘米为单位，在测试时测量）也可以这种方式进行分析，埋藏潜伏期减少，桩高增加，对应更积极的应对方式。

笔记

在行为测试日，给动物护理人员做了笔记，不要更换笼子/水/食物。实验者仅在行为测试完成后才执行这些护理任务，以避免由于测试当天受试者之间的不同住房条件而导致的冲击探针测试中的运动活动的变化。
众所周知，面对环境中的新物体的老鼠会接触它。大鼠通常在30秒内与探针接触（Fucich 等，，2018）。在极少数情况下，大鼠在开始测试后15分钟内不会接近探针接受电击，停止测试并将受试者排除在实验之外，注意排除。
作为埋藏时间的替代措施，也可以在将大鼠返回其家笼后测量“桩高”（即，测试笼中床垫最高点的高度cm）在15分钟的测试会议之后; 请注意，无法从视频录制中获取此度量）。除了从视频得分的“埋藏时间”之外，该度量可以用作“掩埋量”的索引（过程C）。
我们发现并非所有大鼠都显示出埋藏行为，有时高达约20％的大鼠在研究中。如果这导致非正态性，则可能需要应用非参数统计来分析埋葬分数。更重要的是，这可以人为地将埋葬率偏差为零（因为分子将为0），即使不显示埋藏的动物也显示出不同的不动量。因此，为了避免产生误导性的埋葬比率分数，计算埋葬率，任何埋葬分数0都加1秒。在这种情况下，然后将埋葬率计算为（埋藏时间+ 1秒）/（埋藏时间+ 1秒+不动时间），从而保持由不同的不动性得分传达的信息。
我们实验室未发表的研究结果表明，慢性套管植入物对内侧前额叶皮层的手术破坏可以消除埋藏行为。因此，当我们测试这个大脑区域在防御性埋藏中的作用时，我们使用有角度的方法来靶向内侧前额叶皮层，同时用我们的植入物最小化对该区域的组织损伤（参见Fucich 等人，2016年和2018年）。

致谢

这项工作得到国家心理健康研究所资助MH072672和MH053851，国立卫生研究院T32培训基金NS082145，国家推进转化科学研究中心奖学金TL1 TR001119，美国退伍军人事务部生物医学实验室研究与发展计划优异奖1I01BX003512的支持，以及William和Ella Owens医学研究基金会。本文的内容不代表退伍军人事务部或美国政府的观点。该方案改编自Fucich et al。（2018），Roth et al。（2012）和Lapiz-Bluhm 等人发表的程序。（2008）。
DA Morilak获得了Alkermes的研究经费和H. Lundbeck A / S的实物研究支持。这些活动与本文提出的任何工作无关。

利益争夺

作者声明没有利益冲突。

伦理

所有程序均符合NIH指南，并经UTHSCSA机构动物护理和使用委员会批准。

参考

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