材料和试剂

移液器吸头：10毫升，5毫升，2毫升（Axygen）
24孔组织培养处理板（Corning，目录号：3524）（储存条件：15°C至25°C）
6孔组织培养处理板（Corning，目录号：3506）（储存条件：15°C至25°C）
96孔超低附着板（Corning，目录号：3474）（储存条件：15°C至25°C）
40μm细胞过滤器（Corning，目录号：352340）（储存条件：15°C至25°C）
PIK3CA H1047R ; PTEN LOX / LOX ; UBC-CreERT2小鼠（Daniel et al。，2017年和2018年），年龄E13.5或6周龄
注意：NSPC可以更有效地从年轻小鼠中分离出来。这里使用的小鼠是在C57BL / 6遗传背景上。
（可选）抗体
DMEM F12（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：10565042）（储存条件：4°C）
Accutase细胞分离液（BD，目录号：561527）（保存条件：4°C）
胎牛血清（FCS）（Bovogen Biologicals，目录号：SFBS-FR）（储存条件：-20°C）
青霉素 - 链霉素（10,000 U / ml）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：15140-122）（储存条件：-20°C）
B-27补充剂（50x）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：17504-044）（储存条件：-20°C）
表皮生长因子（EGF）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：PHG0313）（储存条件：-20°C）
碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）（BioVision，目录号：4036）（储存条件：-20°C）
层粘连蛋白（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：23017-015）（贮存条件：-20°C）
NaCl（氯化钠，Thermo Fisher Scientific，Ajax Finechem，Univar，目录号：AJA465-500G）
KCl（Postassium Chloride，Merck，目录号：1049360500）
Na 2 HPO 4 （磷酸氢二钠，目录号：106586）
KH 2 PO 4 （正磷酸二氢钾，Thermo Fisher Scientific，Ajax Chemicals，目录号：392）
磷酸盐缓冲盐水（PBS，见食谱）
神经球培养基（见食谱）
差异化媒体（见食谱）

设备

移液器（梅特勒 - 托利多，Pipet-X，型号：PX-100）
生物危害安全柜（EuroClone，型号：BioAir-TopSafe 1.2-ABC）
离心机（Dynamica Scientific，型号：Velocity 18R）
DigiRetina16相机（图森）
Neubauer血细胞计数器（Sigma-Aldrich，目录号：Z359629）
37°C水浴（Froilabo，型号：BMUTE）
加湿培养箱在37°C，5％CO 2 （Thermo Fisher Scientific，Heraeus，型号：Heracell TM 150）
倒置相差显微镜（尼康，型号：Diaphot，ELWD 0.3相衬）

软件

ELDA在线软件（ http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/）

程序

神经球文化
如前所述（Daniel 等人，2017和2018），从PIK3CA-PTEN小鼠分离突变和正常神经干细胞（NSCs）。该方案可用于在神经球培养基中生长的野生型和突变型神经球。
1. 通过与Accutase细胞分离溶液在37℃温育5分钟，将NSCs解离为单细胞悬浮液。
2. 加入2毫升PBS终止解离过程。
3. 通过40μm细胞过滤器过滤混合物。
4. 将神经球细胞培养基加入滤液中。
5. 在300 x g 下离心5分钟。
6. 在NSC培养基中重悬单细胞悬浮液。
7. 使用血细胞计数器进行细胞计数。
8. 将细胞接种到24孔超低附着板中并允许球形成。
9. 将板在37℃，5％CO 2 潮湿的培养箱中孵育7天。
10. 每隔一天补充一半的培养基。
神经球的极限稀释测定（ELDA）
1. 如过程A，步骤1-6中所述，将神经球解离成单细胞悬浮液。
2. 使用血细胞计数器确定细胞数量。
3. 在神经球培养基中将种子细胞密度降低（20,10,5,1个细胞/孔，进入96孔超低附着板）。板24每个细胞密度/数量重复。
4. 在37°C，5％CO 2 潮湿的培养箱中孵育7天（最多14天）。
5. 从第3天开始，使用相差显微镜监测每个孔的球状体形成迹象;照片，必要时。使用DigiRetina16相机（ http://www.tucsen.com ）捕获显示的图像。
6. 在第7天，对包含一个或多个直径大于约20μm的球体的任何孔进行评分。球体尺寸在图像捕获软件使用预先校准的标尺条函数（TCapture5.1软件是免费在 HTTP测定：// www.tucsen.com ）。
7. 通过 http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda将数据输入ELDA软件/ 采用数据分析，步骤3，下面所示的格式。
8. 选择“Plot Results”复选框;默认置信区间设置为0.95。
9. 单击“运行”。
10. 结果图可以打印为PDF，表格结果可用于生成条形图。
  
  图1. ELDA设置的摘要原理图
神经干细胞分化
该方案用于在分化培养基中培养NSC细胞7天，收获细胞，然后在神经球培养基中培养（参见图2F）。
1. 在分化培养基（DMEM-F12,10％胎牛血清，青霉素 - 链霉素[100U / ml]）中重悬NSC单细胞悬浮液。
2. 将1×10 5个细胞/孔接种到6孔标准贴壁细胞培养物处理的平板上，预先用层粘连蛋白包被。
3. 每孔加入2ml分化培养基。
4. 在37℃，5％CO 2 潮湿的培养箱中孵育7天以允许分化。
5. 每隔一天补充一次培养基。
6. 在第7天收获细胞并进行ELDA（程序B）。
7. 任选地，可以在单独的细胞制备物中使用抗GFAP（胶质原纤维蛋白）抗体标记神经胶质细胞来检查NSCs的分化，并且使用抗-Tuj1抗体来标记神经元命运细胞。

数据分析

使用相差显微镜监测球形细胞并捕获野生型和突变体组之间的球体图像。
评估神经球形成单位（NSFU）的数量/接种的细胞数。球体＆gt;对直径为20μm的评分进行评分（图2A-2C）。
使用以下数据准备Excel电子表格。
通过 http://bioinf.wehi.edu.au/software将此信息输入ELDA在线软件/ ELDA / 。
生成具有95％置信区间的图，以在野生型或突变体组之间给出球形成频率（图2D，2E，2G和2H）。

图2.用于评估干细胞样细胞自我更新的极限稀释分析（ELDA）和涉及区分NSCs的中间步骤的变异。 A.接种单个NSC后培养7天后的代表性NSCs，显示两个NSCs但没有形成神经球。白色虚线表示96孔板上孔的内边缘。 B.神经干细胞分裂但自发分化，未显示神经球形成。 C.显示在单个NSC接种后7天后形成单个神经球的孔;这被评为“积极”。 D.使用在线算法显示数据输出的神经球形成能力（程序B）。 E.（D）中计算的干细胞频率倒数的图形表示。注意，PI3K突变细胞比对照NSCs更有效地形成球体。 F.初始ELDA之后的协议流程，用于区分NSCs，然后执行第二个ELDA以测量固有的球形成稳定性。用于（D）和（E）的相同NSC基因型的G和H.ELDA数据输出，在神经球介质中强制分化和重新铺板后。

笔记

ELDA测定可用于研究任何类型细胞的自我更新能力。使用ELDA软件，可以生成球形细胞的频率，并在多个细胞亚群和不同处理之间进行比较。

食谱

10x磷酸盐缓冲盐水，pH 7.3
Milli-Q H 2 O
1,370 mM NaCl
27 mM KCl
81mM Na 2 HPO 4
14.7mM KH 2 PO 4
神经球培养基（最终工作浓度）
DMEM / F12
青霉素 - 链霉素（100 U / ml）
1x B27（50x库存）
10 ng / ml EGF
10ng / ml bFGF
差异化媒体
DMEM / F12
青霉素 - 链霉素（100 U / ml）
10％FCS

致谢

这项工作得到了CASS基金会资助（＃7491）的支持。本文中描述的协议的简要描述最初出现在Daniel et al。＆nbsp;（2017和2018）中。最初的ELDA协议在Hu和Smyth，2009中描述。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考

Daniel，P.，Filiz，G.，Brown，D.，Christie，M.，Waring，P.，Zhang，Y.，Haynes，J.，Pouton，C.，Flanagan，D.，Vincan，E。， Johns，T.，Montgomery，K.，Phillips，W。和Mantamadiotis，T。（2017）。神经干细胞中的PI3K激活可以通过靶向CREB来抑制肿瘤发生。 / a> BioRxiv 143388。
Daniel，PM，Filiz，G.，Brown，DV，Christie，M.，Waring，PM，Zhang，Y.，Haynes，JM，Pouton，C.，Flanagan，D.，Vincan，E.，Johns，TG， Montgomery，K.，Phillips，WA和Mantamadiotis，T。（2018）。神经干细胞中的PI3K激活驱动肿瘤发生，可通过靶向cAMP反应元件结合来改善（CREB））蛋白质。 Neuro Oncol 4月30日doi：10.1093 / neuonc / noy068。
Hu，Y。和Smyth，G。K.（2009）。 ELDA：用于比较干细胞和其他检测中耗尽和富集群体的极限稀释分析。 J Immunol Methods 347（1-2）：70-78。
Kaye，A。H.和Morokoff，A。（2014）。持续进化：脑肿瘤的生物学和治疗。神经外科 61 Suppl 1：100-104。
Mantamadiotis，T。（2017）。针对脑癌中基因表达的PI3K依赖性调控。癌症 9（6）：60。
Quintana，E.，Shackleton，M.，Sabel，M。S.，Fullen，D.R.，Johnson，T。M. and Morrison，S。J.（2008）。单个人黑色素瘤细胞有效形成肿瘤。自然 456（7222）：593-598。
Shackleton，M.，Vaillant，F.，Simpson，K.J.，Stingl，J.，Smyth，G.K.，Asselin-Labat，M.L.，Wu，L.，Lindeman，G.J。和Visvader，J.E。（2006）。从单个干细胞中生成功能性乳腺。 Nature 439（7072）：84-88。
Vaillant，F.，Asselin-Labat，ML，Shackleton，M.，Forrest，NC，Lindeman，GJ和Visvader，JE（2008）。乳腺祖细胞标记物CD61 /β3整合素识别乳腺肿瘤发生小鼠模型中的癌症干细胞。 Cancer Res 68（19）：7711-7717 。