材料和试剂

玻璃毛细管（World Precision Instruments，目录号：1B100F-6）
载玻片（VWR，目录号：631-0108）
手术丝（Ethicon，目录号：EH7790）
手术刀刀片（B. Braun Melsungen，目录号：BB511）
棉签（Lohmann＆amp; Rauscher，目录号：13356）
硝酸纤维素膜（GE Healthcare，目录号：RPN303E）
雄性和雌性小鼠年龄在6-10周之间
CSF1R抑制剂PLX5622（PLX，Plexxikon，商业无法提供）
AIN-76A标准啮齿动物食物（研究饮食）
氯胺酮（Grovet，Alfasan，Medistar，目录号：10002）
甲苯噻嗪（拜耳，Rompun ® 2％注射液25 ml）＆nbsp;
霍乱毒素亚基B，Alexa Fluor TM 555（CTB）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：C22843）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，目录号：14190-094）
多聚甲醛（PFA）（西格玛奥德里奇，目录号：252549）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S9378）
KP-CryoCompound（KLINIPATH，目录号：1620-C）
双蒸H 2 O（Carl Roth，目录号：3478.2）
眼膏（DR.WINZER，Gent-Ophtal ®）
甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：179957）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100）＆nbsp;
Iba1抗体（Wako Pure Chemical Industries，目录号：019-19741，RRID：AB_839504，LOT-特异性浓度：1 mg / ml）
βIII-tubulin抗体（BioLegend，目录编号：801202，RRID：AB_2313773，LOT-特异性浓度：1 mg / ml）
具有多个剪接的RNA结合蛋白（RBPMS）抗体（Abcam，目录号：ab194213，LOT特异性浓度：0.25 mg / ml）
二抗
1. 驴抗小鼠488（Thermo Fisher Scientific，目录号：A-21202，RRID：AB_141607，LOT特异性浓度：2mg / ml）
2. 驴抗兔594（Thermo Fisher Scientific，目录号：A-21207，RRID：AB_141637，LOT特异性浓度：2 mg / ml）
驴血清（Bio-Rad Laboratories，目录号：C06SB）
牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：A3294）
吐温20（西格玛奥德里奇，目录号：P1379）
多聚甲醛（PFA）溶液（见食谱）
蔗糖溶液（见食谱）
阻止解决方案（部分）（见食谱）
阻塞解决方案（wholemount）（参见食谱）

设备

珠宝商的钳子（精细科学工具，目录号：11254-20）
Capsulotomy剪刀（Hermle，目录号：564）
鼠标头支架（KOPF INSTRUMENTS，目录号：921-E）
Cryostat（Leica Biosystems，型号：CM3050 S）
荧光显微镜（蔡司，型号：Axio Observer.D1）
共聚焦激光扫描显微镜（Leica Microsystems，型号：Leica TCS SP8）
双目（ZEISS，型号：Stemi DV4 SPOT）
冷光源（肖特，型号：KL 1600 LED）

软件

Excel 2016（微软）
SigmaStat 3.1（Systat）
Photoshop CS6（Adobe）

程序

小胶质细胞耗尽
注意：＆nbsp;
1. CSF1R抑制剂PLX5622由Plexxikon Inc.以标准AIN-76A啮齿动物饲料配制，浓度为1,200 mg / kg。
2. 所有实验程序均应得到当地动物护理委员会的批准。
1. 将年龄在6-10周之间的雄性和雌性小鼠保持在12小时光照/黑暗周期，随意随意获取食物和水。＆nbsp;
2. 用含有PLX5622的食物交换啮齿动物食物并提供至少21天的小鼠随意访问，以确保最大的消耗效率（图1A，2A和3D）。各对照小鼠接受标准AIN-76A啮齿动物饲料，不含CSF1R抑制剂PLX5622。
3. 21天后，可以收获各自的组织以分析耗尽效率（图3A和3B）。否则，在实验期间将小鼠放在PLX5622-chow上以确保连续的小胶质细胞耗尽。当用抑制剂治疗至少8周时，小鼠不会出现任何可观察到的表型。
  
  图1.视神经损伤和轴突再生的实验装置。：一种。通过施用PLX5622（CSF1R-抑制剂）开始实验的时间表。然后对小鼠进行手术，并且在处死前两天，通过玻璃体内霍乱毒素亚单位B（CTB）注射对视网膜神经节细胞轴突进行顺行标记。 B.视神经挤压手术的设置。工作场所以及仪器应该是无菌的。 C.玻璃体内注射CTB的注射方案。将含有CTB的拉制玻璃毛细管以大约45°-50°的角度重新插入玻璃体中，而不会接触或损坏眼睛晶状体。 D.损伤后21天视神经的共聚焦图像，显示一些CTB阳性再生轴突穿过病变部位（红色虚线）。上面的比例示出了可以计算再生轴突的示例性距离，并且除以该距离处的视神经的宽度，以推断视神经的每个宽度的再生轴突的数量。比例尺=100μm。
眶内视神经挤压
1. 确保工作场所和器械在整个手术过程中保持清洁和无菌，以尽量降低感染风险（图1B）。
2. 通过腹膜内注射甲苯噻嗪（16mg / kg）和氯胺酮（120mg / kg）麻醉小鼠。
3. 检查反射（缩足和角膜反射），以确保在进行手术前完全麻醉。
4. 使用电动剃须刀例如剃掉头部，并在将其固定在鼠标头支架上之前，在鼠标头上进行矢状中线切口。
5. 用手术缝合线固定皮肤左侧，以便在整个手术过程中不受干扰地进入眼眶。
6. 使用＃11手术刀沿着轨道腔切开以进入眶内空间。
7. 如果出血过多，请使用拭子吸收血液，否则会损害您的视力。
8. 使用珠宝商的镊子轻轻移动泪腺，使组织保持完整，以便更好地接近眼睛。
9. 使用囊切开术剪刀切除上斜肌，上直肌和牵开器肺，以进入视神经。注意避免意外的视神经损伤。
10. 一旦可以接触到视神经，使用珠宝钳的镊子并用一致的压力将视神经压在眼球后面大约1 mm，持续10秒。注意压碎整个宽度，否则伤害可能仍然不完整（Fischer et al。，2017）。
11. 将泪腺定位回来并使用无菌手术缝合线缝合伤口。
12. 涂抹眼膏，以防止感染和眼睛干燥。
13. 然后进行手术以研究轴突再生（变体1）或制备视网膜整体用于分析RGC存活（变体2）。
变型1：用于分析神经元再生的顺行追踪
1. 视神经挤压后19天重复步骤B1-B3以确保在玻璃体内注射2μl顺行示踪剂CTB（5μg/μl）之前的最佳手术条件。
2. 用珠宝钳的镊子固定眼睛，用拉动的玻璃毛细管轻轻夹住角膜，从前房排出大约2μl的房水。
3. 用2μl浓缩的CTB溶液填充拉出的玻璃毛细管。
4. 使用一对珠宝商的镊子轻轻拉出眼睛，以更好地进入眼球后表面。以45°-50°的角度进行眼部后入眼，以避免意外的镜片损伤，并将玻璃毛细管插入玻璃体内（图1C）。注射后，迅速将针头从眼球上取下。
5. 两天后，如前所述麻醉小鼠，并用冰冷的PFA溶液心内灌注小鼠（Hilla et al。，2017; Leibinger et al。，2017）。
6. 准备视神经，将其嵌入冷冻组织的包埋介质中，并如前所述进行14μm冷冻切片（Hilla et al。，2017; Leibinger et al。，2017）。
7. 现在可以在荧光显微镜下直接分析这些切片（图1D）。
变型2：准备视网膜整体装置用于分析神经变性
1. 为了分析视神经挤压后给定时间点的RGC变性，根据当地动物护理指南对小鼠实施安乐死。不需要用PFA溶液灌注。
2. 摘除眼睛并将其置于装有PBS的培养皿中。在取下镜头之前，沿锯齿锯切开角膜去除角膜。
3. 在眼杯中做四个径向切口，彼此间隔大约90°（图2B），使光盘保持完整。
4. 通过切断视神经盘和巩膜之间的连接将视网膜从巩膜上分离，并将具有玻璃体的自由浮动视网膜转移到硝酸纤维素膜上，神经节细胞层朝上。
5. 将膜转移到干燥的组织上，让视网膜吸到膜上。返回PBS充满培养皿并重复该步骤至少四次。
6. 使用珠宝商的镊子小心地将玻璃体从视网膜上分离，同时尽量避免损伤视网膜。
7. 在进行染色方案之前，在PFA溶液中孵育30分钟。
  
  图2.视网膜整体制备和视神经损伤后神经元存活的分析。 A.通过施用PLX5622（CSF1R抑制剂）开始实验的时间线。然后，对小鼠进行手术，并在21天后处死，以量化视神经损伤后的视网膜神经节细胞存活。 B.没有角膜和晶状体的去核眼的示意图显示了视网膜中的径向切口的位置以实现三叶草形状。 C.单个视网膜象限的放大解释了图像采集以量化神经元存活。图像记录从乳头（半圆）开始大约1毫米处并且前进到视网膜外部，而图像之间没有重叠。 D.视神经损伤后21天视网膜神经节细胞层的示例性共聚焦图像。 RBPMS染色（绿色）显示RGC somata，而βIII-微管蛋白（品红色）另外突出RGC轴突。底部的合并图片表示两个RGC标记之间的高重叠。比例尺=50μm。
用于定量RGC存活的视网膜wholemount染色
1. 为了分析RGC存活，需要针对合适的神经元标记物染色视网膜整体。
2. 在室温下在湿化室中在PBS中的2％Triton X-100中使视网膜透化1小时。
3. 使用用于整个装置的封闭溶液（参见配方）在室温下在湿化室中封闭组织1小时。
4. 将视网膜与第一抗体（βIII-微管蛋白[1：1,000]或具有多个剪接的RNA结合蛋白[RBPMS，1：500]）一起孵育，在4℃下在湿化室中在封闭溶液中稀释过夜。
5. 用PBS洗去非特异性结合的一抗三次，每次10分钟。
6. 将视网膜与第二抗体（在封闭溶液中以1：1,000稀释）在室温下在湿化室中孵育1小时。
7. 用PBS洗涤非特异性结合的二抗，每次三次，持续10分钟。
8. 为了可视化Iba1阳性小胶质细胞和耗竭效率，可以根据所述方案（视频1和视频2）用在封闭溶液中稀释的1：1,000 Iba1一抗共同染色视网膜。
  
  视频1.准备视网膜整体装置。
  
  视频2.视网膜的耗尽效率。
光学神经染色分析耗竭效率
1. 为了分析耗竭效率，可以对小胶质细胞/巨噬细胞标记物如Iba1进行免疫组织化学染色。
2. 在室温下用100％甲醇将各个部分固定10分钟。
3. 使用阻断溶液在室温下在加湿室中对切片（参见配方）封闭表位30分钟。
4. 将切片与Iba1一抗（在封闭溶液中1：1,000稀释）在加湿室中于4℃孵育过夜。
5. 用PBS洗涤非特异性结合的一抗三次，每次10分钟。
6. 将第二抗体（在封闭溶液中以1：1,000稀释）在加湿室中在室温下孵育1小时。
7. 用PBS洗掉非特异性结合的二抗，每次3次，每次10分钟。
8. 请注意，视神经挤压导致病变部位的血源性巨噬细胞浸润（图3C），大多数小胶质细胞抗体也可检测到这种情况。
  
  图3. PLX对CNS组织中Iba1阳性小胶质细胞的消耗效率 A.来自对照小鼠的幼稚视网膜整体上的最大强度投影共聚焦图像显示整个视网膜及其不同层中的Iba1阳性小胶质细胞。左下方的放大显示神经节细胞层中的小胶质细胞。相反，PLX处理的小鼠在所有视网膜层中缺乏小胶质细胞，导致100％的消耗效率（也参见视频2）。比例尺= 1毫米。 B.Iba1阳性小胶质细胞在幼稚视神经中均匀分布，而PLX应用导致大量小胶质细胞耗竭。与视网膜相反，视神经中偶尔会出现一些小胶质细胞（Hilla et al。，2017）。比例尺=100μm。 C.视神经挤压后21天，Iba1阳性细胞在对照小鼠以及小胶质细胞耗尽小鼠（PLX）的损伤部位积聚，而PLX视神经的其余部分保持缺乏信号。如其他地方所分析的，这些剩余的细胞很可能是浸润的造血巨噬细胞（Hilla et al。，2017）。比例尺=100μm。 D.共聚焦图像显示，PLX的剥夺导致Iba1阳性小胶质细胞重新填充视网膜，强调了连续PLX治疗有效小胶质细胞耗竭的必要性。左下方的框显示了概览中指示区域的神经节细胞层的放大倍数。比例尺= 1毫米。

数据分析

变体1：RGC轴突再生
1. 拍摄整个视神经节的图像。从病变部位开始，朝着交叉的方向前进。
2. 使用合适的图像处理程序（例如，Photoshop）将单个图像排列并合并到完整的视神经。
3. 创建标尺，标记您要分析的病变部位的距离。用视神经覆盖它并以病变部位为起点（图1D）。
4. 量化穿过限定距离的轴突并测量此距离处视神经的宽度。
5. 将超过指示距离的再生轴突的数量除以视神经的宽度：
6. 仅包括来自完整视神经的切片，其中损伤部位之间的组织和最长再生轴突之后1mm的组织未被破坏。
7. 要分析两个不同组之间的数据，请使用双向ANOVA，其中单个组作为第一个变量，距离病变部位的距离作为第二个变量。
8. 一个合适的事后检验提供了有关群体之间的重大差异的信息，另外，还提供了到病变部位的单一距离的显着差异。
变式2：RGC生存
1. ＆nbsp;通过400x物镜从乳头远端开始约1 mm处获取幸存的RGC图像（图2C）。
2. 向外视网膜前进，避免拍摄重叠区域的图像。根据准备，可以记录四到六个图像（图2C和2D）。
3. 用其他三个象限重复上述步骤（数据分析，步骤B1-B2）。
4. 使用合适的软件，量化每个图像的RGC数量，并将它们除以记录区域的面积，以获得RGC密度：
5. 随着RGC密度朝向外视网膜减小，计算一个象限的平均密度值，然后计算所有四个象限的平均密度值。
6. 要分析两组之间的数据，请使用学生的 t - 测试或单向ANOVA，并对两组以上进行适当的事后检验。

笔记

为避免PLX5622降解，必须保持食物干燥，并在笼子中加入少量（ ca。 20克/动物）。
在PLX5622上饮食14-21天后，视网膜的消耗效率为100％，并且具有高度可重复性。然而，在其他CNS组织中，可能残留一些小胶质细胞。如果还分析其他CNS组织的耗竭效率，则视网膜可以用作阳性对照。
在麻醉不完全的情况下，在手术期间，小鼠应在1％异氟烷/ 99％O 2 下接受额外的异氟醚麻醉。
RGC轴突通常仅显示非常有限的再生能力，但是可以通过操纵RGC的再生状态来改善再生结果，例如通过炎性刺激或提供细胞因子（Fischer 等人，，2000）。 ; Leibinger et al。，2016）。
通常，可能需要高暴露时间以清楚地显现视神经远端部分中的单个再生CTB阳性轴突。由于在损伤部位的轴突数量相当高，在宽视场显微镜中的高曝光时间可能导致荧光信号散射到视神经的远端部分。这可能因此将病变部位的假定位置移动到视神经的远端部分。由于这将导致在到病变部位的不同距离处的再生轴突的不正确量化，可能需要在较低暴露时间的病变部位的图像以清楚地识别病变部位位置。
有关眶内视神经挤压和玻璃体内注射的更详细见解可以在其他地方找到（Chiu et al。，2007; Magharious et al。，2011）。

食谱

多聚甲醛（PFA）溶液
108毫升多聚甲醛（37％）
100毫升10倍PBS
ad 1,000 ml ddH2O
蔗糖溶液
30克蔗糖
ad 100 ml ddH 2 O.
阻止解决方案（部分）
0.2克BSA
来自二抗宿主的0.5ml血清（例如，驴血清）
5μlTween20
ad 10毫升PBS
阻塞解决方案（wholemount）
0.2克BSA
来自二抗宿主的1ml血清（例如，驴血清）
5μlTween20
广告10毫升PBS

致谢

这项工作得到了德国研究基金会的支持。我们感谢Plexxikon Inc.提供PLX5622食品。此外，我们感谢Anastasia Andreadaki的技术支持。作者宣称没有利益冲突。该协议改编自先前的工作（Elmore et al。，2014; Hilla et al。，2017）。

参考

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