材料和试剂

移液器吸头10μl，200μl，1,000μl（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：2140-05,2160P，2079）
Primaria TM 6孔板（Corning，目录号：353846）
Primaria TM 组织培养瓶T-75过滤瓶（Corning，Falcon®，目录号：353824）
50毫升锥形管（Corning，Falcon ®，目录号：352098）
聚丙烯微量离心管
T-25烧瓶（康宁，目录号：3056）
T-150烧瓶（康宁，目录号：3151）
0.22μm过滤器（Corning，目录号：430769）
非洲猪瘟病毒野外分离株如ASFV-G（从受感染的猪血清中分离并向猪巨噬细胞中添加血清以繁殖病毒。按照Enjuanes 等人的描述进行滴定，1976）。＆nbsp ;
约克郡猪3-12个月作为献血者
Cas9供体质粒（通过蓝鹭生物定制设计用于感兴趣的目标。参见附带的插入盒序列（补充文件）
Fugene HD（Active Motif，目录号：32042）
gRNA质粒（由蓝鹭生物定制设计用于感兴趣的目标。）
OptiMEM（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：31985062）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）1x，pH 7.0-7.3（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：14190144）
0.5 M EDTA pH 8.0（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：15575020）
Ficoll-Paque PLUS密度梯度为1.077 g / ml（GE Healthcare，目录号：17144002）
RPMI 1640培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：11875093）
γ辐照胎牛血清（GE Healthcare，Hyclone TM ，目录号：SH30071.03）
抗生素 - 抗真菌药（100x）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：15240096）
庆大霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：15750060）
HEPES 1 M（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：15630080）
L-谷氨酰胺，200 nM（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：25030081）
L929培养基（L细胞，L929，菌株L的衍生物）（ATCC，目录号：CCL-1）
肝素（Sagent Pharmaceuticals，目录号：400-10）
L929条件培养基（见食谱）
巨噬细胞洗涤培养基（见食谱）
巨噬细胞完全培养基（见食谱）
PBS + EDTA（见食谱）

设备

P1,000，P200，P20，P10移液器（Gilson）
2升滚瓶（康宁，目录号：431329）
250毫升离心瓶（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，Nalgene TM ，目录号：3141-0250）
倒置荧光显微镜（Carl-Zeiss）
血细胞计数
移液器（Drummond Scientific，目录号：4-000-101）
台式离心机（Eppendorf，型号：5810）
落地式离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，型号：Sorvall ® RC-4）
Sorval SLA-1500固定角转子（Thermo Fisher Scientific，型号：SLA-1500）
涡旋混合器（Fisher Scientific，目录号：12-812）
-70°C冰箱（Thermo Scientific，型号：ULT2586-9-A40）

程序

巨噬细胞分离
1. 通过静脉穿刺获得500ml猪血并用肝素治疗。
2. 将血液在37°C孵育1-2小时，直到观察到红细胞沉降和血液白细胞富集到上清血浆中。
3. 收集血浆并漂浮在50ml Falcon管中的Ficoll-Paque（35ml血浆，10ml Ficoll-Paque）上。
4. 在Eppendorf 5810中以367 x g 在室温下离心30分钟。
5. 收集顶层并将池装入250ml离心瓶中。
6. 在Sorval SLA-1500中在7,500 x g 下在室温下离心20分钟。
7. 收集单核白细胞并通过添加等体积的培养基作为收集的细胞用巨噬细胞培养基洗涤，倒置数次以混合。
8. 在Eppendorf 5810中以367 x g 在室温下离心10分钟。
9. 除去上清液，加入10ml巨噬细胞培养基洗涤细胞，再按步骤8离心，共洗涤3次。
10. 将细胞重悬于10ml巨噬细胞完全培养基中。
11. 将细胞培养成5个Primaria TM T-75烧瓶（每个含有1ml细胞和10ml巨噬细胞培养基）并孵育过夜。
12. 粘附细胞现在被认为是巨噬细胞。
13. 使用PBS EDTA分离细胞，用10ml洗涤并在37℃下用10ml孵育直至细胞脱离（通常15-20分钟）。
14. 在血细胞计数器中使用10μl细胞悬浮液计数巨噬细胞。
15. 在Primaria TM 6孔板中以每孔5×10 6 的密度平板巨噬细胞，并允许连接过夜。
CRISPR / Cas9的感染/转染
1. 用ASFV的野外分离物接种每个孔，例如ASFV-G或ASFV的其他野外分离株，感染复数（MOI）为1.0。通过将病毒直接添加到含有2ml培养基的每个孔的培养基中接种，轻轻摇动平板以混合并在37℃，5％CO 2 下孵育1小时。
2. 将悬浮在ddH 2 O中的1.6μg供体质粒和1.6μggRNA质粒加入150μl在聚丙烯微量离心管中的optiMEM中。＆nbsp;
3. 通过移液或短暂涡旋小心混合。
4. 通过移液加入10μlFugeneHD混合物并孵育10分钟。
5. 向含有2ml培养基的巨噬细胞中滴加150μl复合物。
6. 在37℃，5％CO 2 下孵育24小时。
7. 转染后24小时在荧光显微镜下观察报告基因，以确定转染率。通过观察表达荧光标记物的附着细胞和未附着细胞来计算百分比。＆nbsp;
8. 在-70°C冷冻板，并储存直至准备使用。
9. 从转染中取1 ml冷冻培养基，在巨噬细胞培养基中进行1:10稀释（1：10,1：100,1：1,000; 等）。
10. 将100μl稀释液加入到如步骤B7中制备的6孔巨噬细胞平板中，最终体积为2ml培养基。在37℃，5％CO 2 下孵育。
11. 每24小时观察完整的CPE（细胞病变效应）（通常为1-7天），标记对您的荧光标记呈阳性的孔。如果完全CPE快速发生（<48小时）而没有在任何稀释液中看到您的荧光标记物，则可能需要额外的稀释液 - 进一步稀释转染物可以表达您的报告基因。
12. 当CPE发生时冻结所有平板，并采用表达重组基因的最低稀释液进一步纯化。
13. 继续稀释并通过重组病毒，直到您可以在所有显示CPE的细胞中观察到荧光。建议至少传递5个段落。＆nbsp;
14. 通过对缺失基因的内部部分进行PCR或通过全基因组测序确认缺失基因的纯度。

数据分析

在我们之前的工作中（Borca et al。，2018），我们使用CRISPR / Cas9作为替代方法在原代猪巨噬细胞系中引入ASFV中的基因缺失，并将同源重组率与传统同源物进行比较。重组方法。它表明，使用上述方法中描述的方法，同源重组率增加4个对数。该方法将允许在没有组织培养适应的情况下操纵爆发菌株（及时的过程，通常导致基因组不稳定），并使用新出现的ASFV分离株作为减毒活疫苗的骨干进行定制生产。

笔记

故障排除

低水平的重组病毒
与病毒基因组重组发生需要高转染效率。观察到高转染效率并不意味着已经产生了重组病毒。病毒的第1代确定了重组效率和样品中重组病毒的量。随着传代的增加，重组病毒的数量应该增加。如果不是这种情况，请返回上一段。＆nbsp;
必需基因
如果重组效率低，则靶向的病毒基因可能是必需的。如果是这种情况，尝试部分基因缺失或基因突变。如果基因可以被非重组病毒补充，即使基因是必需的，你也可以在第1代中观察到少量似乎是重组病毒的东西。在重组病毒的第2代中不太可能观察到这种情况。＆nbsp;
巨噬细胞感染不良
巨噬细胞的处理不当和可能的动物变异可导致分离不能支持ASFV感染的细胞。虽然这种情况很少见，但使用不同的动物和小心处理巨噬细胞可以改善感染。

食谱

L929条件媒体
500毫升RPMI 1640培养基
55毫升胎牛血清-γ辐射
12.5毫升HEPES 1 M
5.5毫升L-谷氨酰胺200 nM
5.5毫升抗生素 - 抗真菌药 0.55毫升庆大霉素
条件媒体如下：＆nbsp;
1. 将T-25烧瓶置于总共15ml培养基中的5×10 6 和1×10 5个细胞之间。
2. 当汇合时转移到总共35ml体积的T150烧瓶中
3. 在T150中将细胞汇合，分离并重悬于12ml培养基中
4. 向（d）2L滚瓶中的每一个中加入3ml细胞，并向每个滚瓶中加入250ml L929培养基
5. 允许生长11天
6. 将内容物/培养基倒入250ml离心瓶中
7. 在Sorval SLA-1500中以5,500 x g 离心20分钟
8. 收集上清液并通过0.22μm过滤器过滤
9. 在-20°C冷冻直至使用
巨噬细胞清洗培养基
250毫升RPMI 1640
100毫升FBS
5毫升抗 - 抗 0.5ml庆大霉素50mg / ml
巨噬细胞完整的媒体
250毫升RPMI 1640
150毫升条件L929培养基
100ml FBS（终浓度16.5％）
5毫升抗 - 抗 0.5毫升庆大霉素50毫克/毫升
150毫升供体猪血浆
PBS + EDTA
500毫升PBS
10毫升0.5毫升EDTA

致谢

该项目由奖项编号HSHQDC-11-X-00077和HSHQPM-12-X-00005通过与美国国土安全部科学技术局的机构间协议资助。巨噬细胞分离方案改编自Zsak 等人（1996）。作者声明没有利益冲突或竞争利益。

参考

Borca，M.V.，Holinka，L.G.，Berggren，K.A。和Gladue，D.P。（2018）。 CRISPR-Cas9，一种有效增加重组非洲猪瘟病毒发展的工具。 Sci Rep 8（1）：3154。
Enjuanes，L.，Carrascosa，A.L.，Moreno，M。A.和Vinuela，E。（1976）。滴定非洲猪瘟（ASF）病毒。 J Gen Virol < / em> 32（3）：471-477。
O'Donnell，V.，Holinka，LG，Krug，PW，Gladue，DP，Carlson，J.，Sanford，B.，Alfano，M.，Kramer，E.，Lu，Z.，Arzt，J.，Reese ，B.，Carrillo，C.，Risatti，GR和Borca，MV（2015）。非洲猪瘟病毒格鲁吉亚2007年删除毒力相关基因 9GL （b119L），当以低剂量施用时，导致猪中的病毒减毒并诱导针对同源攻击的有效保护。 J Virol 89（16）：8556-8566。
Okoli，A.，Okeke，M。I.，Tryland，M。和Moens，U。（2018）。用于疫苗和载体开发的CRISPR / Cas9-推进正痘病毒基因组编辑。病毒 10（1）。
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