材料和试剂

移液器吸头（Fisher Scientific，目录号：02-707-80; 02-707-167）
6孔板（康宁，目录号：3506）
0.22μm无菌过滤器（Corning，目录号：431219）
细胞刮刀（Corning，目录号：3010）
10-beta化学感受态 E.大肠杆菌（New England Biolabs，目录号：C3019H）或等效基因型使用Δ（ara-leu）7697 araD139 fhuA Δ lacX74 galK16 galE15 e14-φ80 d lacZ Δ M15 recA1 relA1 endA1 nupG rpsL （Str R ） rph spoT1 Δ（mrr- hsdRMS-的McrBC）
引物
1. 片段A（SacI / NarI）向前与T7序列
  GAAATTAATACGACTCACTATAAGTTGTTAGTCTACGTG
2. 片段A（SacI / NarI）反转
  GTCATAGTGGCGCCTACCATAACCATCACTCTTCCC
3. 片段B（NarI / EcoRV）前进
  GGTTATGGTAGGCGCCACTATGACGGATGAC
4. 片段B（NarI / EcoRV）反向
  CTGCTTCCTGATATCTCTGCCTGGTCTTCCC
5. 片段C（EcoRV / XbaI）前进
  GACCAGGCAGAGATATCAGGAAGCAGTCCAATCC
6. 片段C（EcoRV / XbaI）反转
  AGAACCTGTTGATTCAACAGCAC
7. Ion Torrent P1适配器顶级寡核苷酸
  CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT
8. Ion Torrent P1适配器底部oligo
  ＆LT; PHOS＆GT; ATCACCGACTGCCCATAGAGAGGAAAGCGGAGGCGTAGTGGTT
9. 改良Ion Torrent适配器顶级寡核苷酸
  ＆LT; PHOS＆GT; GGCCGCCTGAGTCGGAGACACGCAGGGATGAGATGGTT
10. 改良Ion Torrent适配器底部寡头
  CGGACTCAGCCTCTGTGCGTCCCTACTCTACC
SacI（New England Biolabs，目录号：R3156）
NarI（New England Biolabs，目录号：R0191）
EcoRV（New England Biolabs，目录号：R3195）
XbaI（New England Biolabs，目录号：R0145）
NotI（New England Biolabs，目录号：R0189）
突变生成系统试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：F-701）
羧苄青霉素（Fisher Scientific，目录号：BP26481）
卡那霉素（赛默飞世尔科技，目录号：11815024）
Promega Wizard Maxiprep套件（Promega，目录号：A7270）
Promega凝胶纯化试剂盒（Promega，目录号：A9281）
m 7 g（5'）ppp（5'）RNA帽结构类似物（New England Biolabs，目录号：S1405S）
琼脂糖（赛默飞世尔科技，目录号：16500100）
Q5聚合酶（New England Biolabs，目录号：M0493）
T7 MEGAscript 体外 RNA翻译试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM1334）
ZYMO Quick-RNA病毒试剂盒（ZYMO RESEARCH，目录号：R1034）
Applied Biosciences高容量cDNA试剂盒（赛默飞世尔科技，目录号：4368814）
Ion Library Taqman定量试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：4468802）
10x TBE（Fisher Scientific，目录号：BP1333）
T4 DNA连接酶（New England Biolabs，目录号：M0202）
T4 PNK（New England Biolabs，目录号：M0201）
dNTPs（赛默飞世尔科技，目录号：R1121）
AMPure XP Beads（Beckman Coulter，目录号：A63881）
LB培养基（Fisher Scientific，目录号：BP1425-500）
PEG 8000（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP233-100）
Vero细胞（ATCC，目录号：CCL-81）
TransMessenger转染试剂（QIAGEN，目录号：301525）
全长登革病毒克隆16681血清型2 cDNA（质粒pD2 / IC-30P-NBX，Huang 等人，2010）。
注意：这个cDNA是疾病控制中心黄博士的慷慨礼物。

设备

注意：不需要特定设备，以下任何型号都应该足够。

平衡
移液器
加热块
恒温箱
热循环仪
水浴
微量
用于Ampure XP珠子净化的磁铁

程序

转座子诱变
该部分描述了在质粒上产生由病毒基因组的cDNA克隆中随机插入的转座子组成的文库的过程。通过使用独特的NotI位点切除大部分1.2kb转座子，随机插入的转座子被还原为含有NotI位点的15个核苷酸，其引入5-氨基酸插入而不引入移码或无义突变。这种插入是TGCGGCCGCAN 1 N 2 N 3 N 4 N 5 其中N 1 N 2 N 3 N 4 N 5 表示五个重复直接插入上游的核苷酸。
对于我们的研究，登革热cDNA克隆被片段化以消除 E中的遗传不稳定性和毒性。用全长黄病毒克隆观察到大肠杆菌。然而，如果全长病毒基因组在 E中具有遗传稳定性和无毒性，则不需要病毒基因组片段化。大肠杆菌。注意，起始质粒不得含有任何NotI限制性位点;如果存在，它们应该被定点突变破坏。
1. 将全长登革病毒克隆16681血清型2 cDNA（在质粒pD2 / IC-30P-NBX，Huang et al。，2010中）分成三个侧翼为SacI和NarI的片段（片段A）， NarI和EcoRV（片段B），EcoRV和XbaI（片段C）（图1，步骤1）和亚克隆回到原始载体，具有修饰的多克隆位点，含有SacI，NarI，EcoRV和XbaI位点（图1，步骤） 2）。
2. 使用突变生成试剂盒中提供的MuA转座酶诱变质粒，将工程转座子随机引入每个质粒中。在这些条件下，每个DNA质粒中只应引入一个转座子。
  1. 通过将质粒大小（以kb计）乘以40 ng来计算每个反应的靶DNA量。
  2. 在30°C孵育反应60分钟，并在75°C加热灭活10分钟。
3. 在无菌无核酸酶水中将转座酶反应稀释10倍至总共200μl，并按照制造商的方案转化为高效recA-感受态细胞，每次转化最多5μl。我们使用化学感受态细胞，但是可以使用电感受态细胞，只要转化效率至少为10 8 cfu /μg。如果使用电穿孔，则应将反应稀释10倍以避免电弧放电。二十个反应应该足以产生至少10的估计核苷酸覆盖度（参见步骤A5）。
4. 选择已转换的 E.在含有羧苄青霉素（以选择质粒）和卡那霉素（以选择转座子）的LB平板上的大肠杆菌。＆nbsp;
5. 计算独立菌落的数量以确定库覆盖率。在此阶段，可以通过将观察到的菌落数除以质粒（病毒cDNA片段加骨架）中的核苷酸总数来计算文库覆盖率。我们建议核苷酸覆盖率至少为10倍。将来自平板的菌落从Promega Wizard Maxiprep试剂盒中刮入重悬浮缓冲液中，并制备质粒DNA。每10,000个菌落应使用一个Promega Wizard Maxiprep柱。
  
  图1.方案示意图。 1.使用独特的限制性酶切位点将全长登革热病毒基因组分成三部分。 2.将片段克隆到干净的载体骨架中。 3.使用突变生成试剂盒独立诱变这些构建体中的每一个以产生含有抗生素抗性的随机插入的转座子，并选择转座子上包含的抗生素抗性的突变构建体。 4.从载体骨架中切除登革热病毒片段并连接回干净载体，以确保转座子仅位于登革病毒片段而不是载体骨架中。 5.接下来，使用由转座子和自身连接构建体引入的独特酶限制性位点去除转座子，留下小的15个核苷酸遗传瘢痕（5aa）。 6.通过PCR与相应的野生型片段平行扩增含有遗传瘢痕的片段。 7.使用PCR将含有遗传瘢痕的片段和野生型片段拼接在一起，以获得全长登革热病毒基因组。 8.转录基因体外并将RNA转染到允许细胞中。从转染中回收可存活的子代病毒，分离RNA并合成cDNA。扩增含有遗传瘢痕的片段。 9.从含有片段的PCR扩增的遗传瘢痕构建下一代测序文库，并测序。显示用于对齐的读取和修剪读取。
6. 转化子将在病毒cDNA片段或载体骨架中含有转座子插入。步骤C6-C8将仅分离病毒cDNA片段内的转座子插入（图1，步骤4）。用Sac1和Nar1（片段1），NarI和EcoRV（片段2），或EcoRV和XbaI（片段3）消化5μg每个质粒文库，并在1％TBE-琼脂糖凝胶上分离。每个消化物应包含四个不同的条带，包括载体骨架，带有转座子插入的载体，病毒cDNA片段和带有转座子插入的病毒cDNA片段。用转座子插入切除对应于病毒cDNA片段的条带并纯化。＆nbsp;
7. 按照制造商的方案，使用T4 DNA连接酶将凝胶纯化的条带重新连接回用适当的相容限制酶消化的原始清洁载体骨架。
8. 按照制造商的方案将连接反应转化为高效感受态细胞，并在含有羧苄青霉素和卡那霉素的LB平板上进行选择。可以用与步骤A5类似的方法再次计算库覆盖率。为了将库覆盖率保持在10倍以上，确保在该步骤中至少回收与步骤A5中回收的菌落一样多的菌落。按步骤A5纯化质粒DNA。＆nbsp;
9. 用NotI消化5μg分离的质粒，并在1％琼脂糖凝胶上电泳。这种消化去除了1.2kb转座子的大部分，留下了15个核苷酸的插入（图1，步骤5）。切除较大的条带并丢弃1.2 kb的转座子片段。＆nbsp;
10. 按照制造商的方案，使用T4 DNA连接酶重新环化凝胶纯化的条带。
11. 按照制造商的方案将连接反应转化为高效感受态细胞，并在LB-羧苄青霉素平板上选择。＆nbsp;
12. 算上 E.大肠杆菌菌落并如步骤A5中那样纯化质粒DNA。为确保高覆盖率，确保至少按照步骤A5和A8计算和回收多少菌落。
病毒基因组转染到允许细胞中本节描述了通过剪接重叠延伸（SOE）PCR，体外转录全长登革热基因组从片段中体外生成全长突变体登革热基因组的过程。 RNA，并将病毒RNA转染到允许的细胞中。为了保持文库复杂性，对每个步骤进行至少三次重复的反应并合并。还应进行几次独立的病毒RNA转染到允许细胞中，以最大限度地减少瓶颈效应。
1. PCR扩增来自前一步骤的诱变的登革热片段文库（图1，步骤6）。
  1. 使用“材料和试剂”中列出的正向和反向引物扩增诱变的片段A，B和C文库。
  2. 此外，扩增相应的野生型病毒片段A，C，AB（使用片段A（SacI / NarI）向前与T7序列和片段B（NarI / EcoRV）反向）和BC（使用片段B（NarI / EcoRV））来自登革病毒克隆16681 pD2 / IC-30P-NBX的未修饰cDNA拷贝的正向和片段C（EcoRV / XbaI）反向片段。
    热循环仪程序：（1）95°C，2分钟; （2）95℃20秒，60℃20秒，72℃1分钟/ kb产物×35个循环; （3）保持在4°C＆nbsp;
2. 在1％琼脂糖凝胶上凝胶纯化PCR产物。
3. 在以下PCR反应中通过重叠延伸（SOE）PCR（图1，步骤7）使用剪接构建全长突变体登革热基因组。剪接突变片段A与野生型片段BC，诱变片段B与野生型片段A和C，和诱变片段C与野生型片段AB。得到的全长基因组将分别在片段A，B或C内包含随机插入。为确保后续步骤有足够的材料，请执行三个独立的反应。
  1. 热循环仪程序：（1）95°C，2分钟; （2）95℃20秒，72℃1分钟/ kb产物×10个循环。
  2. 向每个反应中加入2.5μl10μM片段A正向引物和2.5μl10μM片段C反向引物。
  3. 热循环仪程序：（1）95°C，2分钟; （2）95℃20秒，60℃20秒，72℃11分钟×35个循环; （3）保持在4°C。
4. 在1％琼脂糖凝胶上凝胶纯化全长登革热病毒基因组。
5. 使用T7 MEGAscript试剂盒，使用200 ng纯化的全长基因组进行体外转录。注意，m 7 G（5'）ppp（5'）A RNA帽类似物用于体外转录反应，因为登革病毒RNA具有5'帽，但不需要合成无上限的病毒RNA基因组（例如，丙型肝炎病毒）。
  1. 在37°C孵育反应6小时。为了增加病毒RNA产量，在开始孵育后1小时将1μl10mMATP（在T7 MEGAscript试剂盒中提供）加入到反应中。
  2. 在孵育完成前30分钟，加入1μlT7MEGAscript试剂盒中提供的DNase溶液。
6. 按照制造商的方案，使用ZYMO Quick-RNA Viral试剂盒纯化体外转录的病毒RNA。在50μl预热至70°C的无核酸酶水中洗脱。
7. 定量病毒RNA。我们观察到来自新制RNA的最佳结果，尽管在-80°C下储存仅可忽略不计地降低转染效率。
8. 在病毒RNA转染前一天，在6孔板中的平板允许细胞使得它们在转染当天将为80-90％汇合。对于登革热病毒，在6孔板的每孔中加入3.3×10 5个 Vero细胞。
9. 使用带有4μl增强子和8μl转染试剂的QIAGEN TransMessenger试剂盒每孔转染2.5μg病毒RNA。
  注意：如果使用Vero细胞以外的细胞，应优化RNA与增强子和转染试剂的比例。
10. 转染后2小时洗去转染复合物。
  注意：转染的持续时间将根据细胞类型而有所不同，应通过实验确定。
11. 三天后，从孔中收集上清液，合并并以500μL离心旋转10分钟以澄清。使用一半澄清的上清液感染幼稚细胞并将另一半储存在-80°C作为第1代。通过在感染前一天（1.7 x 10 5 6孔板的每孔细胞，感染后第2天用新鲜培养基替换。
12. 三天后，从孔中收集上清液，合并并以500μL离心旋转10分钟以澄清。使用一半澄清的上清液感染幼稚细胞，并将另一半储存在-80°C作为第2代。如步骤B11所述感染幼稚细胞。三天后，从孔中收集上清液，合并并以500μL离心旋转10分钟以澄清。储存在-80°C作为第3道。
病毒后代基因组的分离和下一代测序文库制备
1. 通过PEG沉淀浓缩来自第1,2和3代上清液的病毒。
  1. 在PBS中制备40％（w / v）PEG8000溶液，并通过0.22μm无菌过滤器过滤。
  2. 向上清液中加入40％PEG8000至终浓度为8％PEG8000，并在4℃下孵育过夜。
  3. 在4,500℃下以7,500 x g 离心4小时。
  4. 除去上清液，通过移液管将沉淀轻轻重悬于1ml无菌PBS中。
2. 将重悬的病毒分成三等体积，按照制造商的程序使用ZYMO Quick-RNA Viral试剂盒分离各病毒RNA。以每柱20μl的体积洗脱并汇集纯化的病毒RNA。
3. 使用Applied Biosciences High Capacity cDNA试剂盒按照制造商的程序将纯化的病毒RNA逆转录成cDNA。使用来自步骤C2的所有60μl洗脱的RNA制备cDNA，并在制备cDNA后汇集。
4. PCR扩增含有转座子插入的基因组片段的回收cDNA，使用设计用于生成较小~250 bp扩增子的引物用于下一代测序。
  
  热循环仪程序：（1）95°C，2分钟; （2）95℃20秒，60℃20秒，72℃1分钟/ kb产物×35个循环; （3）保持在4°C。
5. 使用Promega凝胶纯化试剂盒的PCR纯化方案清洗扩增子。
6. 在该方案的这个阶段，可以对扩增子进行定量分析并提交用于文库制备和下一代测序。
新一代测序文库制备
该协议的这一部分生成与Torrent PGM测序兼容的库。注意，文库制备方案已被修改以选择含有DNA片段的NotI，以富集含有NotI位点的转座子插入位点的测序读数。通过将一个衔接子平端连接到DNA片段的每个末端，用NotI切割，并连接含有NotI的读取适配器，我们创建了测序文库，其中每个读数包含插入位点。原则上，该策略可以适用于生成与Illumina测序兼容的文库，但这必须由用户开发。
1. 将来自步骤C5的扩增子以等摩尔方式组合以产生总共1μg的输入DNA。
2. 用T4 PNK处理输入DNA以使末端磷酸化以用于随后的衔接子连接。
  
  在37°C孵育反应30分钟，并在65°C加热灭活20分钟。
3. 将Ion Torrent P1适配器顶部和Ion Torrent P1适配器底部混合在无菌无核酸酶水中，每种寡核苷酸的最终浓度为44μM。将含有混合物的管在充满水的烧杯中加热至100℃1分钟，将烧杯从加热中取出，并使其在台面上冷却至室温。
4. 钝器将磷酸化的扩增子连接到Ion Torrent P1适配器。
  
  在25℃下孵育反应60分钟。
5. 根据制造商的方案，使用72μl的AMPure XP珠子以1.8个珠子体积与反应体积的比例清洁反应，并在35μl无菌无核酸酶水中洗脱。
6. 与NotI的消化反应。
  
  在37°C孵育反应60分钟，并在65°C加热灭活NotI 20分钟。
7. 如步骤D4中那样使用AMPure XP珠子清洁反应，并在34μl无菌无核酸酶水中洗脱。
8. 退火改良离子Torrent适配器顶部和改良Ion Torrent适配器底部寡核苷酸，如步骤D3中所述。
9. Ligate对退火的改良型Ion Torrent A适配器的反应。
  
  在16°C孵育反应90分钟。
10. 如步骤D4中那样使用AMPure XP珠子清洁反应，并在35μl无菌无核酸酶水中洗脱。
11. 按照制造商的方案，使用Ion Torrent Library定量试剂盒对文库进行定量。
12. 提交定量文库以在Ion Torrent PGM上测序。

数据分析

将测序序列定位到病毒基因组，并且对不熟悉生物信息学的个体来说，列举这些结果可能具有挑战性。应建立与经验丰富的生物信息学家的合作，以帮助产生准确的结果。以下是确定基因组中耐受小插入位点的方法的广泛概述。

获取测序结果的原始读数（例如FASTQ文件）。接下来，将读取分成两组;一开始含有TGCGGCCGCAN 1 N 2 N 3 N 4 N 5 读取（图1，步骤9）和另一个不包含该确切序列的读数。＆nbsp;
修剪每个读数的前十个核苷酸以去除转座子插入的序列（图1，步骤9），并留下登革热基因组序列用于比对。
仅使用修剪的读数，使用BOWTIE2的默认设置将读数对齐到登革热基因组。 BOWTIE2可以从 http://www.sourceforge.net 获得。
获取对齐文件，并为每次读取提取对齐的起始位置。由于转座酶引起的插入重复，该位点位于实际插入的上游5个碱基处（参见程序A），因此这些比对位点应减少5。
列举病毒基因组中每个位点的读数。
通过将插入位点计数除以测序运行的总读数来标准化读数，因此您可以比较多个测序运行。

笔记

上述协议中提供了详细的配方。每个制造商的协议中都提供了故障排除提示，在执行实验之前应该阅读这些提示以突出执行所述实验的潜在问题。

致谢

该方案改编自几个先前的转座子插入诱变研究（Arumugaswami et al。，2008; Beitzel et al。，2010; Teterina et al。，2011; Thorne et al。，2012; Remenyi et al。，2014）。作者没有披露利益冲突。我们感谢Claire Huang博士（CDC）的pD2 / IC-30-P-NBX感染性cDNA克隆。这项工作得到美国国立卫生研究院拨款R01DK097374（A.W.T.）和密歇根临床与健康研究所（MICHR）拨款UL1TR002240（J.W.P.）和密歇根大学胃肠道研究中心（UMCGR）的资助，授予5P30DK034933。

参考

1Arumugaswami，V.，Remenyi，R.，Kanagavel，V.，Sue，E.Y.，Ngoc Ho，T.，Liu，C.，Fontanes，V.，Dasgupta，A。和Sun，R。（2008）。丙型肝炎病毒基因组的高分辨率功能分析。 PLoS Pathog < / em> 4（10）：e1000182。
Beitzel，BF，Bakken，RR，Smith，JM和Schmaljohn，CS（2010）。 High-通过插入诱变和大规模平行测序解析委内瑞拉马脑炎病毒基因组的功能映射。 PLoS Pathog 6（10）：e1001146。
Eyre，N.S。，Johnson，S.M.，Eltahla，A.A.，Aloi，M.，Aloia，A.L.，McDevitt，C.A.，Bull，R.A。和Beard，M。R.（2017）。登革热病毒的全基因组突变揭示了NS1蛋白的可塑性，并能够产生感染性标记的报告病毒。 J Virol 91（23）。＆nbsp;
Fulton，B.O。，Sachs，D.，Schwarz，M.C.，Palese，P。和Evans，M。J.（2017）。寨卡病毒基因组的转座子突变突出了RNA复制必需的区域，并限制免疫逃避。 J Virol 91（15）。
Huang，C.Y.，Butrapet，S.，Moss，K.J.，Childers，T.，Erb，S.M.，Calvert，A.E.，Silengo，S.J.，Kinney，R.M.，Blair，C.D。和Roehrig，J.T。（2010）。登革病毒2型包膜蛋白融合肽对膜融合至关重要。病毒学 396（2）：305-315。
Remenyi，R.，Qi，H.，Su，SY，Chen，Z.，Wu，NC，Arumugaswami，V.，Truong，S.，Chu，V.，Stokelman，T.，Lo，HH，Olson，CA ，Wu，TT，Chen，SH，Lin，CY和Sun，R。（2014）。丙型肝炎病毒基因组的综合功能图提供了探测病毒蛋白的资源。 MBio 5（5）：e01469-01414。
Teterina，N.L.，Lauber，C.，Jensen，K.S。，Levenson，E.A.，Gorbalenya，A.E。和Ehrenfeld，E。（2011）。鉴定脊髓灰质炎病毒非结构蛋白中的耐受插入位点。病毒学 409（1）：1-11。
Thorne，L.，Bailey，D。和Goodfellow，I。（2012）。诺如病毒基因组的高分辨率功能分析。 J Virol 86（21）：11441-11456。