材料和试剂

移液器吸头，100-1,250μl（VWR，目录号：89079-470）
移液器吸头，1-200μl（VWR，目录号：89079-478）
移液器吸头，0.1-10μl（VWR，目录号：89079-464）
1.5毫升Eppendorf管（Corning，Axygen ®，目录号：MCT-150-C）
0.2 ml PCR管（VWR，目录号：20170-012）
Parafilm（Bemis，目录号：PM996）
50毫升离心管（Greiner Bio One，目录号：227261）
Nalgene TM 过滤器（Thermo Fisher Scientific，目录号：595-4520）
Phaeodactylum tricornutum 细胞[藻类和原生动物的培养物收集（CCAP，UK），目录号：1055/1]在50 ml Falcon管中生长
TransforMax TM EPI300 TM 化学上有能力的 E.大肠杆菌细胞（Lucigen，目录号：C300C105）
pKS diaCas9_sgRNA质粒（Addgene，目录号：74923）＆nbsp;
BsaI-HF限制性内切酶（New England Biolabs，目录号：R0535S）
P1缓冲液（QIAGEN，目录号：19051）
β-巯基乙醇（VWR，目录号：97064-588）
碱性裂解（P2）缓冲液（QIAGEN，目录号：19052）
中和（P3）缓冲液（QIAGEN，目录号：19053）
异丙醇（Sigma-Aldrich，目录号：190764）
95％（v / v）EtOH（商品醇，目录号：P016EA95）
带缓冲液的T4 DNA连接酶（New England Biolabs，目录号：M0202S）
2-丙醇-205（Caledon Laboratories，目录号：8601-7-40）
BSA（Sigma-Aldrich，目录号：A2058）
BsaI（New England Biolabs，目录号：R0535S）
EZ-10旋转柱Miniprep Kit（Bio Basic，目录号：BS614）
EZ-10离心柱PCR产物纯化试剂盒（Bio Basic，目录号：BS363）
Bacto琼脂（BD，Bacto TM ，目录号：214030）
Agar A（Bio Basic，目录号：FB0010）
酵母提取物（BioShop，目录号：YEX401）
细菌学胰蛋白胨（BioShop，目录号：TRP402）
氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，Fisher Chemical，目录号：S271-500）
AmpliTaq 360 DNA聚合酶，10x缓冲液和25 mM氯化镁（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems TM ，目录号：4398828）
Zeocin TM （InvivoGen，目录号：ant-zn-5p）
氨苄青霉素（BioShop，目录号：AMP201.100）
硫酸庆大霉素（Bio Basic，目录号：GB0217）
D-葡萄糖（BioShop，目录号：GLU501.1）
Zymolyase 20 T（BioShop，目录号：ZYM001.1）
Tris（Fisher Scientific，Fisher BioReagents，目录号：BP152-5）
甘油（Fisher Scientific，Fisher Chemical，目录号：G33-1）
硫酸钠（Na 2 SO 4 ）（Fisher Scientific，Fisher Chemical，目录号：S421-300LB）
氯化钾（KCl）（Merck，默克密理博中国，目录号：PX1405-1）
碳酸氢钠（NaHCO 3 ）（Merck，默克密理博中国，目录号：SX0320-1）
溴化钾（KBr）（科学公司，目录号：NC-2136）
硼酸（H 3 BO 3 ）（BioShop，目录号：BOR001.1）
氟化钠（NaF）（Sigma-Aldrich，目录号：S7920）
氯化镁六水合物（MgCl 2 •6H 2 O）（BioShop，目录号：MAG510.1）
氯化钙二水合物（CaCl 2 •2H 2 O）（Fisher Scientific，目录号：C79-3）
氯化锶六水合物（SrCl 2 •6H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：255521）
硝酸钠（NaNO 3 ）（Fisher Scientific，目录号：S343-500）
磷酸二氢钠一水合物（NaH 2 PO 4 •H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：S9638）
氯化铁（III）六水合物（FeCl 3 •6H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：236489）
Na 2 EDTA•2H 2 O（Bio Basic，目录号：EB0185）
硫酸铜（II）五水合物（CuSO 4 •5H 2 O）（Bio Basic，目录号：CDB0063）
钼酸钠二水合物（Na 2 MoO 4 •2H 2 O）（Avantor Performance Materials，目录号：3764-01）
硫酸锌七水合物（ZnSO 4 •7H 2 O）（Alfa Aesar，目录号：A12915-36）＆nbsp;
氯化钴（II）六水合物（CoCl 2 •6H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C3169）
氯化锰（II）四水合物（MnCl 2 •4H 2 O）（BioShop，目录号：MAN222）
亚硒酸（H 2 SeO 3 ）（Sigma-Aldrich，目录号：229857）
硫酸镍（II）（NiSO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：656895）
原钒酸钠（Na 3 VO 4 ）（BioShop，目录号：SPP310）
铬酸钾（K 2 CrO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：216615）
硫胺素-HCl（Sigma-Aldrich，目录号：47858）
生物素（Sigma-Aldrich，目录号：B4639）
Cyanocobalamin（Sigma-Aldrich，目录号：C3607）
酶原解决方案（见食谱）＆nbsp;
P的裂解缓冲液。三角酵母细胞（见食谱）
LB培养基（见食谱）
SOC媒体（见食谱）
LB琼脂平板（见食谱）含有100μg/ ml -1 氨苄青霉素或100μg/ ml -1 氨苄青霉素和40μg/ ml -1 庆大霉素
50％L1,5％LB，1％琼脂平板（1升）（见食谱）
L1媒体（见食谱）
含有50μgml- 1 Zeocin TM的L1琼脂平板（见食谱）
2x含水盐（参见食谱）
NP库存（见食谱）
1,000x L1痕量金属（参见配方）
维生素溶液（见食谱）

设备

Qubit ® 2.0荧光计（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，型号：Qubit ® 2.0，目录号：Q32866）
加热块（VWR，目录号：13259-030）
水浴（Fisher Scientific，型号：IC 2100）
微量移液管（PIPETMAN，可变容积）
双目显微镜（Leitz Wetzlar，型号：Labolux12）
血球＆NBSP;
台式离心机（Hettich Lab Technology，目录号：2004-01）
离心机（Beckman Coulter，型号：Avanti ® J-26 XPI，目录号：393127）
PCR热循环仪（Bio-Rad Laboratories，型号：T100 TM ，目录号：1861096）
紫外可见分光光度计（Biochrom，型号：ULTROSPEC 2100 ®，目录号：80-2112-21）
培养箱摇床（Thermo Fisher Scientific，型号：Large Incubated and Refrigerated，目录号：SHKE5000-7）
涡流
高压灭菌器
冰箱

程序

设计靶向脲酶基因的Cas9-sgRNA
1. 从Addgene（107932或107999）获得pKSconj diaCas9或diaTevCas9（pPtGE34或pPtGE35）质粒（图1）。
  
  图1. pKSconj的质粒图谱。 diaCas9 / diaTevCas9（pPtGE34 / pPtGE35）
2. 下载 P. tricornutum 脲酶基因序列。 NCBI Gene ID：7194881（PHATRDRAFT_29702）。
3. 使用序列标识符格式化FASTA格式的序列，第1行前面带有＆gt;然后是核苷酸序列。＆nbsp;
4. 使用自定义Perl脚本搜索脲酶基因中的Cas9和TevCas9 gRNA靶位点，在5'-CNNNG-3'I-TevI切割位点下游约15bp处（参见补充文件）。典型的TevCas9目标站点如图2所示。
  
  图2.具有预测删除大小的TevCas9目标站点的插图
5. 从 P的预测站点列表中选择四个目标站点。 trincornutum 脲酶基因。订购对应于预测的gRNA结合位点的寡核苷酸（表1中用下划线的序列）和互补的寡核苷酸。设计具有顶部链5'-TCGA-3'和底部链3'-CAAA-5'BsaI限制性切割位点突出端的寡核苷酸，以便于克隆到Cas9和TevCas9载体中（表1）。
  
  表1. P中靶向脲酶基因的gRNA序列。 tricornutum
将gRNA克隆到pKSconj diaCas9和pKSconj diaTevCas9质粒中
1. 对有序寡核苷酸进行磷酸化和退火以产生gRNA克隆插入物。在0.2ml PCR管中制备50μlgRNA磷酸化反应（表2）。将反应物置于热循环仪中并在37℃下孵育30分钟，然后在95℃下变性5分钟。接下来，以-1℃min -1 的速率缓慢冷却至50℃，以允许gRNA顶部和底部链的退火。
  
  表2. gRNA磷酸化的试剂
2. 使用Golden Gate组装将gRNA克隆到pKSconj diaCas9和pKSconj diaTevCas9质粒中（表3）。将反应物置于热循环仪中并按照表4中所述运行方案。
  
  表3.金门装配的试剂
  
  表4.金门组件的热循环仪设置
3. 将产品从金门反应转换为Epi300 E。使用热休克的大肠杆菌细胞如下：对于一次反应，将3μl金门装配产品与30μlEpi300 E混合。大肠杆菌细胞。将反应在冰上孵育30分钟并在42℃热激45秒，然后在冰上孵育2分钟。向反应中加入400μlSOC并在37℃下以225RPM振荡回收细胞90分钟。将150μl回收的细胞置于LB +氨苄青霉素培养基上，并在37℃下孵育16小时/过夜。
4. 第二天，将1至5个菌落接种到含有3ml LB +氨苄青霉素的单独玻璃试管中，并在37℃下以225RPM振荡孵育16小时/过夜。
5. 过夜生长后，取3ml过夜培养物以分离质粒DNA（Bio Basic Inc.质粒小量制备试剂盒）。使用gRNA插入位点上游的测序引物，在伦敦地区基因组学中心发送用于Sanger测序的分离的质粒DNA，以鉴定含有正确克隆的gRNA的质粒。＆nbsp;
6. 将正确克隆的gRNA质粒转化到Epi300 E中。含有pTA-Mob（Strand et al。，2014）质粒的大肠杆菌，来自Rahmi Lale博士，使用步骤3中描述的热休克方案，含有1μl质粒和30 μl的 E.大肠杆菌细胞。
将质粒转移到 P中。 tricornutum 通过 E的结合。大肠杆菌
注意：该协议改编自已发布的协议（Karas等，2015）。
1. P上。三角褐指藻生长条件：冷白色荧光灯下的温度为18°C（75μEm -2 sec -1 ），光周期为16 h，光照时间为8 h在西部大学Biotron实验气候变化研究中心的50毫升Falcon管中黑暗。＆nbsp;
2. 简而言之，调整250μl P.将tricornutum 液体培养至1.0×10 8个细胞ml -1 ，平板接种到50％L1,1％琼脂平板上，并生长4天。
3. 向板中加入2ml L1培养基，刮取细胞并收集到1.5ml Eppendorf管中。
4. 使用血细胞计数器计数细胞，并将浓度调节至5×10 5 sup / ml细胞ml-1。
5. 增长3毫升 E.含有带有gRNA的diaCas9或diaTevCas9质粒的大肠杆菌培养物在37℃过夜。将1 ml过夜培养物稀释至50 ml含有100μg/ ml -1 氨苄青霉素和40μg/ ml -1 庆大霉素的LB，并将培养物培养至OD 600 0.8-1.0。
6. 将培养物在50ml Falcon管中以3,000μLg/ g离心培养物10分钟。
7. 弃去上清液，将沉淀重悬于500μlSOC培养基中。
8. 混合200μl P.步骤4中的tricornutum 与200μl E。来自步骤7的大肠杆菌，将它们铺在50％L1,5％LB，1％琼脂平板上。
9. 将板在30℃孵育90分钟，然后在18℃光照下孵育2天。
10. 2天后，向板中加入1.5ml L1培养基，刮擦并收集1.5ml Eppendorf管中的细胞。
11. 将500μl刮下的细胞置于含有50μg/ ml -1 Zeocin TM 的50％L1,1％琼脂平板上。
12. 将板封口并将板在18℃下用光孵育14天。典型的缀合实验应该产生1.0×10 2 - 1.3×10 4 总共结合物。
在 P中筛选脲酶敲除。由Cas9和TevCas9诱导的三角褐指藻（参见图3的筛选程序概述） - T7核酸内切酶I检测

图3. P的筛选程序概述。 tricornutum 尿素酶敲除。 pKSconj diaCas9或pKSconj diaTevCas9质粒被递送至 P. tricornutum 由 E。大肠杆菌。用T7EI试验筛选出结合物。从excjugants中分离亚克隆，并通过将亚克隆接种到尿素和硝酸盐平板上进行表型筛选。通过Sanger Sequencing验证删除长度。
1. 14天后，随机选择10个 P.将三角酵母与结合物偶联并将它们划线到L1 + Zeocin TM 平板上并生长7天。
2. 从一条条纹上刮下50％的细胞，并将其置于3ml含有50μg/ ml 1 Zeocin TM 的L1培养基中。将其他50％的细胞悬浮在100μlTE（pH 8.0）缓冲液中，在-80℃下快速冷冻15分钟，并在95℃下加热裂解5分钟。＆nbsp;
3. 使用裂解的 P.使用AmpliTaq DNA聚合酶将tricornutum excjugant细胞作为用于PCR扩增gRNA靶位点的模板。设计PCR，使用位于gRNA靶位点上游和下游约250bp的引物，产物约为500bp。在1％琼脂糖凝胶上分析PCR产物以确认PCR产物的大小和存在。＆nbsp;
4. 使PCR产物在95℃下变性5分钟并缓慢冷却至50℃，然后在-20℃下冷冻样品2分钟以产生编辑和未编辑的靶位点的异源双链体。
5. 使用PCR产物作为T7EI测定的底物（表5）。将反应在37℃孵育15分钟，并在1％琼脂糖凝胶上分析消化的产物。来自excjugant的PCR产物在琼脂糖凝胶（500bp和250bp）上产生两条带，包含Cas9或TevCas9在靶位点的编辑。 T7EI测定凝胶的一个例子如图4所示。
  
  表5.T7EI检测的试剂
  
  图4.通过T7EI测定分析Cas9活性的实例。 P上。将三角褐藻菌落重悬于TE（pH8.0）缓冲液中，然后在-80℃下快速冷冻15分钟，然后在95℃下细胞裂解12分钟。对脲酶基因靶位点进行PCR扩增。将PCR产物在95℃变性并冷却至50℃以允许随机再退火。使用随机退火的PCR产物作为模板进行T7E1测定，并在37℃下用T7EI和NEB 2缓冲液孵育15分钟。将产物在100V下加载到1％琼脂糖凝胶上40分钟。星号（*）表示对编辑有积极作用的菌落。数字（11.12,11.13 ......）代表不同的殖民地。
6. 从 P的步骤D2稀释液体培养物。鉴定出具有编辑至10 -4 并且在L1 + Zeocin TM 平板上培养并且生长10-14天以获得亚克隆的三角酵母结合物。
脲酶敲除的表型筛选（参见图5的表型筛选实例）
1. 首先使用移液管尖端将含有2.1 mM尿素的L1 + Zeocin TM 平板亚克隆，使用相同的尖端将亚克隆划线到L1 + Zeocin TM上含有4.2mM硝酸盐的平板并生长5天。使用硝酸盐在L1 + Zeocin TM 上生长但在L1 + Zeocin TM 上与尿素生长的亚克隆是脲酶敲除。
  
  图5. P的表型屏幕示例。尿酸盐和硝酸盐平板上的亚克隆 Cas9和TevCas9亚克隆的稀释液用硝酸盐和L1与尿素平板一起点在L1上。
2. 如在步骤D2-D3中，PCR扩增靶位点，从鉴定为脲酶敲除的亚克隆中发送PCR产物用于Sanger测序。
从尿素酶敲除亚克隆中固化pKSconj diaCas9和diaTevCas9质粒
1. 将鉴定的脲酶敲除亚克隆接种在3ml不含Zeocin TM 的L1培养基中并生长7天。
2. 7天后，稀释（10 -4 ）并将液体培养物平板接种到L1平板上并生长7天以获得单菌落。
3. 随机选择10个菌落并将它们划线到L1和L1 + Zeocin TM 平板上并生长5天。在L1平板上但不在L1 + Zeocin TM 平板上生长表明质粒成功固化的菌落。

数据分析

P的十个exconjugants。随机选择含有不同gRNA的pKSconj diaCas9或diaTevCas9质粒的tricornutum 进行T7EI分析。＆nbsp;
从那些中，随机选择5个亚克隆进行表型筛选。＆nbsp;
为了确定质粒的去除，随机选择10个菌落进行Zeocin灵敏度筛选。

笔记

当使用不同的gRNA时，可能需要设计多个gRNA，因为Cas9和TevCas9的活性变化。
编辑的菌落数可能会有所不同，可能必须选择更多的exconjugants来识别已编辑的克隆并获得更准确的编辑效率。

食谱

Zymolyase解决方案
200毫克酶解酶20 T（USB）
9毫升dH 2 O
1毫升1M Tris pH 7.5
10毫升50％甘油
P的裂解缓冲液。 tricornutum 细胞（1 L）
10毫升1M Tris pH 8.0
2毫升0.5毫升EDTA
988ml dH 2 O.
LB培养基（1升）
10克胰蛋白胨
5克酵母提取物
10克NaCl
1 L dH 2 O
通过高压灭菌器在121℃，1大气压下灭菌15分钟
SOC媒体（1升）
20克胰蛋白胨
5克酵母提取物
0.5克NaCl
10毫升250毫米KCl
5毫升2M MgCl
20毫升1M葡萄糖
900毫升dH 2 O.
LB琼脂平板（含有100μg/ ml -1 氨苄青霉素或100μg/ ml -1 氨苄青霉素含40μg/ ml -1 庆大霉素）（1 L ）
10克胰蛋白胨
5克酵母提取物
10克NaCl
15克琼脂
0.1克氨苄青霉素或0.1克氨苄青霉素和0.4克庆大霉素
1 L dH 2 O.
50％L1,5％LB，1％琼脂平板（1L）
500毫升L1
50毫升LB
10克bacto琼脂
L1媒体（1 L）
500毫升2x Aquil盐
2毫升NP库存
500μl维生素溶液
1毫升1,000x L1微量金属
497.5 ml dH 2 O
用Nalgene TM 过滤器真空过滤灭菌
L1琼脂含有50μg/ ml -1 Zeocin TM （1 L）
500毫升L1媒体
10克bacto琼脂
0.5克ZeocinTM
500毫升dH 2 O.
2x Aquil盐（1升）
24.5克NaCl
4.09g Na 2 SO 4
0.7克KCl
0.2克NaHCO 3
0.1 KBr
0.03g H 3 BO 3
0.003克NaF
11.1g MgCl 2 •6H 2 O
1.54g CaCl 2 •2H 2 O
0.017g SrCl 2 ·6H 2 O.
NP库存（100毫升）
37.5g NaNO 3
2.5 g NaH 2 PO 4 •H 2 O
1,000x L1痕量金属（1 L）
3.15 g FeCl 3 •6H 2 O
4.36g Na 2 EDTA•2H 2 O
0.25 ml CuSO 4 •5H 2 O（9.8 g L -1 dH 2 O）
3.0 ml Na 2 MoO 4 •2H 2 O（6.3 g L -1 dH 2 < / sub> O）
1.0 ml ZnSO 4 •7H 2 O（22.0 g L -1 dH 2 O）
1.0 ml CoCl 2 •6H 2 O（10.0 g L -1 dH 2 O）
1.0 ml MnCl 2• 4H 2 O（180.0 g L -1 dH 2 O）
1.0ml H 2 SeO 3 （1.3 g L -1 dH 2 O）
1.0 ml NiSO 4 •6H 2 O（2.7 g L -1 dH 2 O）
1.0 ml Na 3 VO 4 （1.84 g L -1 dH 2 O）
1.0 ml K 2 CrO 4 （1.94 g L -1 dH 2 O）
维生素溶液（1升）
200毫克硫胺素-HCl
10毫升0.1克L -1 生物素
1毫升1克L -1 氰钴胺素

致谢

这项工作得到了设计师微生物公司的支持，这是NSERC ENGAGE Grant给D.R.E.和Designer Microbes Inc.（EGP / 486420-2015），安大略卓越中心VIP-1授予Designer Microbes Inc.（OCE-VIP-1/23879），以及NSERC Discovery Grant授予D.R.E. （RGPIN-2015-04800）。
该协议是从以下发表的论文开发的：Slattery et al。（2018）。作者声明没有利益冲突。

参考

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