材料和试剂

移液器吸头（Eppendorf，目录号：022491105,022491113,022491121,022491164）
微量离心管（Fisher Scientific，目录号：05-408-130）
12孔细胞培养板（Greiner Bio One International，目录号：665102）
40μm过滤器（Corning，Falcon ®，目录号：352340）
微量离心管磁铁（New England Biolabs，目录号：S1509S）
Dynabeads：绵羊抗大鼠IgG（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：11035）
LYVE-1抗体，0.5 mg / ml（R＆amp; D Systems，目录号：AF2125）
Trizol溶液（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：15596018）
RNA Prep Kit（QIAGEN，目录号：74106）
牛血清白蛋白（Rockland Immunochemicals，目录号：BSA-50）
PBS没有Ca 2 + 和Mg 2 + （Merck，Omnipur ®，目录号：6505-OP）
胶原酶（Sigma-Aldrich，目录号：10103578001）
Dispase（Sigma-Aldrich，目录号：D4693-1G）
DNase（Thermo Fisher Scientific，Ambion TM ，目录号：AM2224）
HBSS（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：14175095）
氯化铵（NH 4 Cl）（Merck，Calbiochem，目录号：168320）
碳酸氢钠（NaHCO 3 ）（默克，目录号：SX0320-1）
Na 2 EDTA（EDTA二钠）（VWR，目录号：97061-022）
分子级水（Sigma-Aldrich，目录号：W4502-1L）
PBS / BSA解决方案（参见食谱）
酶解决方案（见食谱）
RBC裂解缓冲液（见食谱）

设备

孵化器（Fisher Scientific）
离心机（Eppendorf，型号：5415 R）
NanoDrop TM 2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，型号：NanoDrop TM 2000）

程序

Dynabead准备

移取500μlDynabead溶液（50μl/胚胎）到微量离心管中。
置于微量离心管磁铁上，取出溶液。
用1 ml PBS / 0.1％BSA洗涤Dynabeads，轻轻旋转3分钟。
将试管置于微量离心管磁铁上并弃去上清液。＆nbsp;
重复步骤A3-A4一次。
加入1 ml PBS / 0.1％BSA。＆nbsp;
向重悬的Dynabead溶液中加入100μgLYVE-1 mAb（10μg抗体/胚胎）。
在4°C孵育30-45分钟，轻轻旋转。
将管置于磁铁上并丢弃上清液。
通过在1ml PBS / BSA溶液中轻轻移液（100μl/胚胎）重悬Dynabeads。储存在4°C直至需要。

胚胎解剖和内皮细胞分离

在E14.5安乐死孕鼠;去除子宫并分离胚胎。
暴露胚胎的腹部并尽可能多地去除肝脏组织（见注释）。
将胚胎切成4-5个较小的块，并将组织在1ml酶溶液中在37℃下消化30分钟。每10分钟向上和向下移取几次混合物。
使用无菌12孔细胞培养板和40μm过滤器，过滤每种混合物以除去碎片;用0.5-1ml冷HBSS冲洗。
将每个过滤的溶液转移到单独的微量离心管中。
在4℃下将细胞溶液在600 x g 下旋转1分钟。丢弃上清液。＆nbsp;
重悬于500μlRBC裂解缓冲液中，上下移液数次。在台面上休息5分钟。＆nbsp;
在4℃下以600 x g 旋转细胞1分钟。
将细胞重悬于1ml冷PBS / 0.1％BSA中。
向每个样品中加入100μl制备的Dynabead-LYVE-1溶液（来自步骤A10）。＆nbsp;
在4°C孵育45分钟-1小时，轻轻旋转。
将每个管放在磁铁上5分钟;丢弃上清液。＆nbsp;
用1ml冷PBS / BSA洗涤沉淀两次，用1ml移液管尖端轻轻上下吹扫几次。
将每个管放在磁铁上5分钟;丢弃上清液。＆nbsp;
向每个管中加入0.5ml Trizol溶液。立即使用或在-80°C下冷冻以备后用。＆nbsp;
使用QIAGEN prep kit分离RNA。

数据分析

使用分离试剂盒分离RNA后，应在进行任何下游实验之前检查RNA的纯度和质量。出于该实验的目的，仅选择260/280比率为1.9-2.1的样品用于RT-qPCR实验。使用Thermo Fisher Scientific Nanodrop 2000装置评估纯度。但是，标准分光光度计也可用于评估质量。

笔记

LYVE-1受体的生理作用仍然存在争议，以及在小鼠胚胎发育过程中哪个组织表达受体的时间点。 LYVE-1由窦状肝细胞（一种特殊类型的血管）高度表达，因此在消化胚胎之前去除肝脏将提高分离淋巴管内皮细胞的纯度。
虽然该方案描述了用于分离细胞和直接获得用于定量实时PCR分析的RNA的方法，但是它可以适用于多种下游目的。例如，在B部分的步骤14之后，可以从Dynabeads（根据制造商的说明书）洗脱细胞，这将允许采用替代的下游方法（细胞培养或荧光激活细胞分选[FACS]），这取决于个人的需求。

食谱

PBS / BSA解决方案
向含有Ca 2 + 和Mg 2 + 的PBS中加入0.1％牛血清白蛋白

酶解决方案
2.5 mg / ml胶原酶
2.5 mg / ml dispase
25μg/ ml DNase
10毫升HBSS
3. RBC裂解缓冲液解决方案

150mM NH 4 Cl（氯化铵）MW = 53.49	2克
10mM NaHCO 3 （Bicarbinate钠）MW = 84.01	0.21克
1mM Na 2 EDTA（EDTA二钠）MW = 372.2	0.09克
蒸馏的H 2 O	250毫升致谢该程序是在俄克拉荷马州俄克拉荷马市的俄克拉荷马医学研究基金会的Courtney Griffin博士的实验室中开发的。没有利益上的冲突。参考 Banerji，S.，Ni，J.，Wang，S.X.，Clasper，S.，Su，J.，Tammi，R.，Jones，M。和Jackson，D.G。（1999）。 LYVE-1，CD44糖蛋白的新同源物，是透明质酸的淋巴特异性受体。 J Cell Biol 144（4）：789-801。＆nbsp; Jackson，D.G。（2003）。重新审视淋巴管：透明质酸受体LYVE-1的新视角。趋势Cardiovasc Med 13（1）：1-7。