材料和试剂

移液器吸头（Starlab，目录号：S1112-1830）
1.5毫升Eppendorf式微量离心管（Starlab，目录号：S1615-5500）
50毫升Falcon离心管（Corning，目录号：352070）
15厘米组织培养皿（Thermo Fisher Scientific，目录号：168381）
pH试纸（Sigma-Aldrich，目录号：P4536-100EA）
Titansphere TiO 2 珠，5μm（Hichrom，目录号：5020-75000）
PBS（赛默飞世尔科技，目录号：20012019）
0.25％胰蛋白酶-EDTA（Thermo Fisher Scientific，目录号：25200056）
双蒸水（ddH 2 O）或Milli-Q水（Millipore）
高氯酸，70％（Sigma-Aldrich，目录号：244252-1L）
氢氧化铵，28-30％（Sigma-Aldrich，目录号：221228-1L）
1 M高氯酸（见食谱）
~2.8％的氢氧化铵（见食谱）

设备

移液器（Gilson，型号：P1000和P200，目录号：F123602，F123601）
冰盒
平衡（Acculab，型号：ALC-80.4）
加湿培养箱（Eppendorf，型号：Galaxy ® 170 R，目录号：CO17311002）
台式离心机（Eppendorf，目录号：5702000365）
带冷却的台式离心机（LaboGene，型号：ScanSpeed 1730R）
Rotator（Cole-Parmer，Stuart，型号：SB3）
注意：这应该放在冰箱或冷藏室里。
涡旋混合器（科学工业，型号：Vortex Genie 2，目录号：SI-0266）
离心蒸发器（Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen，目录号：RVC 2-18）
倾斜台（Cole-Parmer，Stuart，目录号：SSM4）
细胞刮刀（Greiner Bio One International，目录号：541070）

程序

在开始提取之前

打开冷却的离心机和离心蒸发器。
准备2.5％的氢氧化铵和1M的高氯酸。使用前冷却至4°C。
注意：稀氢氧化铵溶液可以预先制备，并在室温或4°C下无限期保存。检查pH是否> 10，使用前涡旋混合。
将4mg /样品的二氧化钛珠粒称入Eppendorf。通过移液或涡旋将所有珠子悬浮在1ml ddH 2 O中，然后在4℃下以3,500 x g 离心1分钟。除去上清液，再用1 ml 1M高氯酸洗涤。去除上清液并将珠子悬浮于每个样品50μl1M高氯酸中，然后等分到正确数量的Eppendorf中。
注意：可以通过移液或涡旋混合珠子。它们不会保持悬浮状态，因此在等分时会频繁混合。剪切应力不会损坏珠子;标准移液器吸头可用于此协议。

准备细胞

在标准条件下培养感兴趣的细胞系，例如在具有5％CO 2 的37℃加湿培养箱中培养。
注意：对于二氧化钛纯化后的PAGE分析，准备足够的细胞，每种条件下10 mg当量的总蛋白质。使用PAGE分析的二氧化钛纯化已经在许多细胞类型中得到验证（Wilson等人，2015）。根据感兴趣的IP，细胞类型或分析方法，可能需要更多或更少的细胞。
用温PBS洗涤一次，然后在胰蛋白酶-EDTA中孵育直至细胞分离。将它们收集到Falcon管中并以200 x g 离心3分钟。去除上清液。
将细胞重悬于1ml冷PBS中，并在冰上转移至Eppendorfs。调整体积使所有样品的体积大致相同，然后将40μl移入单独的Eppendorf中。这些细胞用于标准化;它们现在可以计数，或者例如，提取以量化蛋白质浓度。
将细胞在200 x g 离心3分钟并除去上清液。样品可立即加工或在-80°C冷冻。

高氯酸提取

将沉淀的细胞重悬于1ml冷的1M高氯酸中。通过移液混合直至完全悬浮。当蛋白质沉淀时，样品将立即变白并变浑浊。
注意：使用冷冻细胞时，在添加高氯酸之前无需对样品进行除霜。
将样品在冰上孵育10-15分钟，经常以2-5秒的涡旋间隔孵育。
注意：许多肌醇磷酸盐物种，特别是肌醇焦磷酸盐，在酸性条件下是不稳定的。因此，在加入氢氧化铵之前的所有步骤应在4℃下进行以使降解最小化，并且酸孵育时间应保持最小。从某些样品类型中提取可能需要更长时间的培养。
在4℃下以18,000 x g 离心5分钟。颗粒含有膜和蛋白质。诸如IP的小极性分子将在上清液中。

二氧化钛珠净化

将来自步骤C3的上清液转移至步骤A3中制备的含有二氧化钛珠粒的Eppendorfs。涡旋短暂混合。
将样品在4°C下旋转15-20分钟。
在4℃下以3,500 x g 离心1分钟。小心地丢弃上清液，因为IP将与二氧化钛珠粒结合。
注意：肌醇焦磷酸盐可以通过吸附到珠子上以及酸性条件下降解。该方案需要1.5-2小时，具体取决于样品编号，不包括离心蒸发所需的时间。
通过重悬于500μl冷的1M高氯酸中，在4,500℃下以3,500×g离心1分钟洗涤珠子，然后除去上清液。重复此步骤。
将珠子重悬于200μl~2.8％氢氧化铵中以洗脱IP。涡旋或移液管混合，然后旋转样品5分钟。
在3,500 x g 离心1分钟。将上清液转移到新的Eppendorf。
再用另外200μl氢氧化铵洗脱。旋转和离心后，将上清液与第一个上清液合并，加入400μl样品。
使用离心蒸发器将样品体积减少至20-60μl，或直至pH值为7-8。在样品达到中性pH值之前，请勿存放样品。在此过程中，样品可加热至60°C，以加速蒸发。如果样品被意外干燥，则重新悬浮在ddH 2 O中。
注意：通过在pH试纸上点样1-2μl来测试样品的pH值。
将中和的样品保存在4°C。它们非常稳定，可以在分析前保存几周。

笔记

在该方案中，我们已经描述了通过胰蛋白酶消化收获细胞，但是可以根据实验目标使用其他方法。在代谢物提取方案中，希望尽可能快地淬灭细胞代谢，以获得细胞内浓度的最真实图像。对于贴壁细胞的最佳淬灭：快速除去培养基，然后在5ml冷PBS（15cm培养皿）中洗涤两次。加入足够的冷的1M高氯酸覆盖板（3-5ml）。将培养皿在4°C的倾斜台上孵育10-15分钟。小心地将高氯酸去除到Falcon管中并离心以去除污染的碎屑。将上清液转移到新管中并进行二氧化钛纯化。从高达10-20毫升的体积中可以几乎完全回收IP（Wilson et al。，2015）。或者，洗涤后，将细胞在1ml冷PBS中刮擦，转移至Falcon或Eppendorf，离心，弃去上清液，并重悬于更方便体积的高氯酸中。与胰蛋白酶消化细胞相比，刮擦时细胞产量降低。通过立即提取或刮擦收获的主要缺点是没有可能为了标准化目的而保存等份的细胞。如果实验需要标准化，例如，按细胞数量，必须为此平行准备额外的菜肴。
从二氧化钛珠粒中洗脱IP非常有效，允许重复使用珠粒。在ddH 2 O中洗涤两次，并在4℃下储存在ddH 2 O中。如果遗留物是一个问题，要么从洗过的珠子中再次洗脱并进行预期的下游分析以确认缺乏IP，或每次使用新鲜的珠子。我们推荐的珠子具有确定的直径并且用于科学用途。廉价的化妆品级二氧化钛粉末可在网上购买;我们发现它从细胞提取物中纯化IP更差，尽管可能使用更多的量会补偿。
除了IP之外，其他含磷酸盐的分子将使用酸提取和二氧化钛珠子从细胞中共纯化。这些包括核苷酸和其他含磷酸盐的代谢中间体。因此，该方案可用于富集许多不同的目标小分子以进行适当的下游分析。当通过PAGE分析时，共纯化核苷酸如GTP和ATP与IP 6 ，IP 7 和IP 8 分开解析（图1）。

图1.通过PAGE可以将较高的IP与共纯化污染物分子分开。用甲苯胺蓝染色的该代表性PAGE凝胶显示使用二氧化钛珠从人结肠癌细胞系HCT116纯化的IP。使用相当于20mg总蛋白质的细胞量。来自 Dictyostelium discoideum 的无机多磷酸盐（polyP）和IP 6 ，IP 7 和IP 8 显示为标记。先前通过与标准物的共迁移和酶处理（植酸酶降解IP，腺苷三磷酸双磷酸酶降解核苷酸）证实了每个条带的特性。 Unk乐队的身份不明。

食谱

1 M高氯酸
1. 对于200毫升，将17.2毫升原液（70％，11.6毫升）与182.8毫升ddH 2 O混合
2. 储存在室温或4°C
~2.8％的氢氧化铵
1. 对于30ml，将3ml原液（28-30％）与27ml ddH 2 O混合
2. 在室温下储存

致谢

这项工作得到了英国医学研究委员会（MRC）对MRC / UCL分子细胞生物学大学实验室（MC UU 1201814）核心支持的支持。该协议是最初在（Wilson et al。，2015）中描述的扩展和略微修改的版本。作者声明他们没有利益冲突。

参考

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