材料和试剂

1移液器吸头
200μl（FUKAEKASEI和WATSON，目录号：110-705C）
1,000μl（FUKAEKASEI和WATSON，目录号：110-706C）
PCR管和条带
管（FUKAEKASEI和WATSON，目录号：137-333C）
Cap（FUKAEKASEI和WATSON，目录号：137-432C）
一次性塑料盘（用于BG-11板）（KANTO KAGAKU，型号：CSPD90-15，目录号：96930-01）
93毫升试管（用于培养）（MonotaRO，IWAKI，目录号：09184061）
制造商：IWAKI，目录号：TEST30NP。
聚赖氨酸涂层玻璃载玻片（Matsunami Glass，目录号：S7441）
盖玻片（MonotaRO，目录号：CT18189）
超声波管（microtube AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap）（Covaris，目录号：520077）
铝箔
Synechococcus elongatus PCC 7942菌株（巴斯德培养物收集）
S的基因组DNA。细长 7942（每个PCR反应10-50 ng）
ExTaq PCR Kit（TaKaRa Bio，目录号：RR001A）
荧光-12-dUTP（罗氏诊断，目录号：11427857910）
随机引物DNA标记试剂盒（Roche Diagnostics，目录号：11004760001）
99.5％乙醇（KANTO KAGAKU，目录号：14032-08）
3 M NaOAc溶液（pH 5.2）（KANTO KAGAKU，目录号：37092-00）
糖原（20 ng / ml）（Roche Diagnostics，目录号：10901393001）
Triton X-100（NACALAI TESQUE，目录号：35501-02）
Formamide（KANTO KAGAKU，目录号：16062-00）
多聚甲醛（KANTO KAGAKU，目录号：32034-12）
二甲基亚砜（KANTO KAGAKU，目录号：10378-00）
氢氧化钠（KANTO KAGAKU，目录号：37184-00）
甲醇（KANTO KAGAKU，目录号：25183-00）
PBS粉末（Sigma-Aldrich，目录号：P3813）
溶菌酶（Wako Pure Chemical Industries，目录号：122-02673）
Tris-HCl（pH 7.5）（Sigma-Aldrich，目录号：T3253-250G）
EDTA（NACALAI TESQUE，目录号：15111-45）
氯化钠（KANTO KAGAKU，目录号：37144-00）
柠檬酸三钠二水合物（KANTO KAGAKU，目录号：37150-00）
甘油（KANTO KAGAKU，目录号：17029-00）
DAPI（Sigma-Aldrich，目录号：D9564-10MG）
鲑鱼精子DNA（罗氏诊断，目录号：11467140001）
用于可视化 oriC 或 terC 的三组PCR引物（Eurofins Genomics，表1）

表1.用于制备FISH探针的引物列表
BG-11液体培养基（pH 8.2）（Castenholz，1988）
BG-11板（pH 8.2）（Castenholz，1988）
杂交解决方案（见食谱）
固定解决方案（见食谱）
PBS缓冲液（见食谱）
溶菌酶溶液（见食谱）
20x标准柠檬酸盐（SSC）（见食谱）
安装解决方案（见食谱）

设备

移液器
P20（吉尔森，目录编号：F123600）
P200（吉尔森，目录号：F123601）
P1000（吉尔森，目录号：F123602）
热循环仪（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems，型号：Veriti）
微管离心机（TOMY SEIKO，型号：MX-107）
Covaris S-2超声波仪（Covaris，Woburn，MA，USA）
植物生长室（TOMY SEIKO，型号：CLE-405）
紫外/可见分光光度计（Shimadzu，型号：UV-1800）
制药冰箱（Panasonic，型号：MPR-3120CN-PJ）
用于染色的玻璃桶（AS ONE，型号：1-4398-01和1-4398-11）
Forma直接加热CO 2 培养箱（Thermo Fisher Scientific，型号：Forma TM 310，目录号：320）
荧光显微镜（Olympus，型号：BX53和DP71;过滤器：用于DAPI的U-FUW和用于叶绿素的U-FGW，目标：UPLSAPO 100XOPH）
一体化荧光显微镜（奥林巴斯，型号：FSX100，过滤器：用于DAPI的U-MNUA2，用于FISH信号的U-MWIBA3，用于叶绿素的U-MWIG3，物镜：UPLSAPO，超级复消色差）
注意：此系统是获取清晰FISH图像所必需的。

软件

DP71相机软件（奥林巴斯）
FSX 100软件（Olympus，FSX-BSW）
Adobe Photoshop Elements 11（Adobe Photoshop，CC）

程序

DNA探针的制备

为了创建探针模板，扩增覆盖包含 oriC 区域的序列的三个DNA片段（引物Ori1-F和Ori1-R，Ori2-F和Ori2-R，以及Ori3-F和Ori3-R），表1）和三个片段，包括推定的 terC 区域（引物Ter1-F和Ter1-R，Ter2-F和Ter2-R，以及Ter3-F和Ter3-R，表1）使用ExTaq使用热循环仪进行PCR（参见制造商的说明）。然后将扩增的序列用于创建探针模板（图1）。
为了获得片段化的DNA（<100bp），使用Covaris S-2超声波仪对DNA进行超声处理（占空比：5％;强度：3;循环/爆发：200;时间：45秒;循环次数：2）（图1）。该破碎步骤对于渗透细胞膜是必需的。
乙醇沉淀：向反应混合物中加入1/10体积的乙酸钠（pH5.2），1/10体积的糖原和2.5体积的乙醇，并在冰上冷却10分钟。在20,000 x g 离心20分钟，并使用500μl70％乙醇洗涤沉淀。
将沉淀溶解在10-50μl无菌水中，并使用UV / Vis分光光度计测定DNA浓度。
使用随机引物DNA标记试剂盒标记1μg模板DNA片段（参见制造商的说明）和荧光-12-dUTP作为标记底物（图1）。通过在100℃加热10分钟使模板DNA变性并立即在冰上冷却10分钟。加入10μl六核苷酸混合物，2.5μl荧光-12-dUTP，dNTP储备混合物，并用无菌水填充至95μl。通过加入5μlKlenow酶开始标记反应，并在37℃下孵育15-20小时。
通过乙醇沉淀除去任何剩余的未掺入的底物（参见步骤A3）。加入100μl杂交溶液以溶解标记的探针DNA（最终浓度10ng /μl）。
在杂交前，立即通过在100°C加热10分钟使探针变性，然后在冰上冷却。

图1. DNA探针的制备方案

准备 S. elongatus 7942文化

划线并预孵育 S.在30℃下在连续照射（40μE/ m 2 / sec）下在植物生长室中在BG-11琼脂平板上延伸细胞 7942细胞1周。
将细胞悬浮于约1ml BG-11培养基中的BG-11琼脂平板上，并接种到100ml玻璃管中的80ml BG-11培养基中，OD 750 约0.1。
将培养物在30℃下在连续照射（40μE/ m 2 / sec）下孵育，并用2％CO 2 在空气中鼓泡24小时。
收获5毫升细胞培养物，并在4,100℃下以3,100 离心10分钟，然后如下所述使沉淀的细胞固定。

固定

将细胞沉淀悬浮于100μl培养基中，加入1 ml冷冻固定液，在-80°C下孵育5分钟。
将固定的细胞在20,000 x g 下离心1分钟，用1ml PBS洗涤细胞沉淀两次，并将细胞储存在-30℃直至进一步分析。
通过荧光显微镜评估固定细胞的质量（细胞形状，染色体形态和叶绿素荧光）。对于该评估，将一些固定细胞与含有DAPI（最终浓度为5μg/ ml）的4μl固定溶液混合，并使用Olympus BX53荧光显微镜进行分析（图2）。与未处理的细胞相比，固定细胞的叶绿素荧光应该降低。如果观察到固定细胞的细胞大小显着减少，则在步骤C1中将培养时间缩短至-80℃。
注意：未孵育时观察到DAPI的荧光。为避免荧光减少，我们用铝箔覆盖了载玻片。

图2.固定细胞的细胞形状和染色体形态的评估。固定的细胞用DAPI染色并用荧光显微镜检查。所示图像如下：亮视野（A），DAPI染色（B）和叶绿素荧光（C）。比例尺=2μm。

鱼类

将固定的细胞沉淀（方法C，步骤2）重悬于PBS中的1ml 0.05％（w / v）Triton X-100中，并在室温下孵育15分钟。
在20,000 x g 离心1分钟，然后用1ml PBS洗涤两次。
为了透化，将细胞沉淀重悬于1ml 0.2mg / ml溶菌酶的PBS溶液中，并在37℃下孵育30分钟。
在20,000 x g 离心1分钟，然后用1 ml PBS洗涤细胞沉淀两次。
用移液管尖端在聚-L-赖氨酸涂覆的载玻片上点样并涂布10μl固定细胞悬浮液，然后在室温下风干。
为了清洗载玻片，将每个载玻片浸入装满水的玻璃桶中，并从玻璃桶中取出载玻片。
将每个载玻片在冷的（-30℃）70％乙醇中在玻璃桶中孵育5分钟，然后在另外两个玻璃桶（90％，然后100％）中在室温下洗涤载玻片5分钟。接下来，将载玻片风干。
如上所述，在每个载玻片上加入5μl含有用荧光-12-dUTP标记的变性探针的杂交溶液。然后在42°C的湿润室中培养载玻片过夜（Forma TM 直接加热CO 2 培养箱，室内底部有一个充满水的大桶）。＆nbsp ;
杂交后，用50％甲酰胺在1×SSC中于37℃在玻璃桶中洗涤载玻片两次，每次10分钟。用玻璃桶中的2x和4x SSC溶液在室温下洗涤载玻片5分钟。
在室温下空气干燥载玻片，然后将5μl安装溶液施加到载玻片上。用盖玻片密封载玻片，然后在Olympus FSX100荧光显微镜下检查。拍摄三个细胞图像：DAPI（激发：360-370nm，发射：420-460nm），叶绿素荧光（激发：530-550nm，发射：575nm）和FISH荧光（激发：460-495nm），发射：510-550 nm）（图3）。

图3.原始图像。使用 ori 探针通过荧光原位杂交（FISH）检查固定细胞，其覆盖约13 kb包围 ori 区域。显示了DAPI染色的细胞（A），细胞的固有叶绿素荧光（B）和FISH焦点（C）。比例尺=20μm。

数据分析

使用FSX 100（FSX-BSW）的软件合并图像。
将亮度和对比度的变化均匀地应用于整个图像以及同一数据集中的所有相应图像。
使用Adobe Photoshop裁剪和调整图像大小，并通过显示DAPI荧光，叶绿素荧光，FISH焦点来排列图像（图4）。

图4. ori 区域和推定的ter区域在 S. elongatus 7942细胞中的分布。通过荧光检测固定细胞使用 ori （A）和 ter 探针（B）进行原位杂交（FISH），其覆盖每个区域约13kb。显示了内在的叶绿素荧光（Chl），FISH焦点（FF），DAPI染色的细胞（DS）和合并的图像。比例尺=2μm。

食谱

杂交溶液（100毫升，-20°C储存）

Formamide

50毫升

20x SSC

10毫升

三文鱼精子DNA

10毫克

ddH 2 O

高达100毫升

固定液（10毫升，预先准备）

多聚甲醛

0.1克

二甲基亚砜

1毫升

10 N NaOH

20μl

甲醇

8.88毫升

PBS缓冲液（室温下储存）

PBS粉末

9.6克

ddH 2 O

最高1升

高压灭菌器（A.C.）（120℃，20分钟）

溶菌酶溶液（10毫升，预先制备）

溶菌酶

2毫克

1M Tris-HCl（pH 7.5）

250μl

0.5 M EDTA

200μl

PBS

9.55毫升

20x标准盐水柠檬酸盐（SSC）（1升，室温下储存）

NaCl

175.32克

C 6 H 5 Na 3 O 7 •2H 2

88.23克

用HCl将pH调节至7.0

ddH 2 O

最高1升
A. C.（120°C，20分钟）

安装溶液（1毫升，储存在4°C）

DAPI（0.2 mg / ml）

25μl

PBS

975μl

致谢

该方案改编自Watanabe 等人（2018）。这项工作部分得到了日本教育，文化，体育，科学和技术部的赠款25850056和17H05451的支持。作者声明没有利益冲突。

参考

Binder，B.J。和Chisholm，S.W。（1995）。细胞周期调控海洋 Synechococcus sp。菌株。 Appl Environ Microbiol 61（2）：708-717。
Castenholz，R。W.（1988）。蓝藻的培养方法。 Meth Enzymol 167：68 -93。
Chen，A。H.，Afonso，B.，Silver，P。A. and Savage，D。F.（2012）。蓝细菌 Synechococcus elongatus中染色体重复和分离的时空组织 PCC 7942. PLoS One 7（10）：e47837。
Griese，M.，Lange，C。和Soppa，J。（2011）。蓝细菌中的倍性。 FEMS Microbiol Lett 323（2 ）：124-131。
Jain，I。H.，Vijayan，V。和O'Shea，E。K.（2012）。染色体的空间排序增强了蓝细菌中染色体分配的保真度。 Proc Natl Acad Sci USA 109（34）：13638-13643。
Labarre，J.，Chauvat，F。和Thuriaux，P。（1989）。通过随机克隆抗生素抗性基因进入蓝藻 Synechocystis基因组的插入诱变菌株PCC 6803. J Bacteriol 171（6）：3449-3457。
Mann，N。和Carr，N.G。（1974）。控制蓝绿藻中的大分子组成和细胞分裂 Anacystis nidulans 。 J Gen Microbiol 83（2）：399-405。
Watanabe，S.，Noda，A.，Ohbayashi，R.，Uchioke，K.，Kurihara，A.，Nakatake，S.，Morioka，S.，Kanesaki，Y.，Chibazakura，T。和Yoshikawa，H。（ 2018）。 ParA样蛋白影响蓝细菌 Synechococcus elongatus中多拷贝染色体的分布 PCC 7942. 微生物学 164（1）：45-56。
Watanabe，S.，Ohbayashi，R.，Kanesaki，Y.，Saito，N.，Chibazakura，T.，Soga，T。和Yoshikawa，H。（2015）。蓝细菌滞后期间的强化DNA复制和代谢。 PLoS One 10（9）：e0136800。
Watanabe，S.，Ohbayashi，R.，Shiwa，Y.，Noda，A.，Kanesaki，Y.，Chibazakura，T。和Yoshikawa，H。（2012）。蓝藻多拷贝染色体的光依赖和异步复制。 Mol微生物 83（4）：856-865。