材料和试剂

用于细胞培养材料
1. 无菌100毫米聚苯乙烯培养皿（Thermo Fisher Scientific，目录号：172931）
2. 无菌平底96孔板（Thermo Fisher Scientific，目录号：167008）
3. 无菌60毫米聚苯乙烯培养皿（Thermo Fisher Scientific，目录号：150288）
4. 无菌6孔板（Thermo Fisher Scientific，目录号：140675）
5. 无菌50 ml锥形离心管（Thermo Fisher Scientific，目录号：339652）
质粒和细胞系
1. 慢病毒载体：
  pWPI-blasticidin-NLS-GFPn-INTEINn（Genbank：KY067203）
  pWPI-嘌呤霉素-INTEINc-GFPc-NLS-IPS（Genbank：KY067204）（用于构建Huh7.5.1-VISI-GFP细胞系）
  pWPI-blasticidin-NLS-mCherry（n）-INTEINn（Genbank：KY067205）
  pWPI-嘌呤霉素-INTEINc-mCherry（c）-NLS-IPS（Genbank：KY067206）（用于构建Huh7.5.1-VISI-mCherry细胞系）
2. 两种辅助质粒：
  psPAX2（HIV-1包装质粒）
  pMD2.G（水疱性口炎病毒糖蛋白[SV-G]表达载体）
注：慢病毒载体和两种辅助质粒由R. Bartenschlager教授友情提供。
1. 293T细胞（ATCC，目录号：CRL-3216）
2. Huh7.5.1细胞（人肝细胞衍生细胞系Huh7.5.1由F. Chisari教授友情提供）
HCV病毒株
1. HCV JC1（GenBank：JF343782.1）
2. 亚基因组JFH1（sgJFH1）（GenBank：AB114136.1）
注：由T. Wakita教授，C. M. Rice教授，J. Bukh教授和R. Bartenschlager教授友情提供。
用于细胞培养基
1. 1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：10010049）
2. 0.25％胰蛋白酶（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：25200072）
3. DMEM（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：C11965500CP）
4. 胎牛血清（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：10099141）
5. 100x非必需氨基酸（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：11140050）
6. 100x青霉素/链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：15140122）
7. 完整的DMEM（见食谱）
转录体外
1. MEGAscript ® T7转录试剂盒（赛默飞世尔科技，目录号：AM1333）
用于电穿孔缓冲液
1. ATP（赛默飞世尔科技，目录号：R0441）
2. L-谷胱甘肽（Sigma-Aldrich，目录号：V900456-25G）
3. 氯化钾（KCl）（国药化学试剂，目录号：10016318）
4. 氯化钙（CaCl 2 ）（上海实验试剂，目录号：117600）
5. 磷酸氢二钾（K 2 HPO 4 ）（上海实验试剂，目录号：168120）
6. 磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）（上海实验试剂，目录号：175650）
7. HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H4034-25G）
8. EGTA（Sangon Biotech，目录号：E0732-50G）
9. 氯化镁（MgCl 2 ）（国药化学试剂，目录号：10012818）
10. Cytomix缓冲液（见食谱）
对于磷酸钙（CaPO 4 ）转染缓冲液
1. HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H4034-25G）
2. 氯化钠（NaCl）（国药化学试剂，目录号：10019318）
3. 磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 ·12H 2 O）（上海实验试剂，目录号：174710）
4. 氯化钙（CaCl 2 ）（上海实验试剂，目录号：117600）
5. 磷酸钙（CaPO 4 ）转染缓冲液（见食谱）
HCV中和抗体
1. 抗体AR3A
  注意：AR3A由M. Law教授提供。
用于细胞系选择
1. 嘌呤霉素（Sigma-Aldrich，目录号：P8833-25MG）
2. 杀稻瘟素（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：R21001）

设备

Electroporator（Bio-Rad Laboratories，型号：Gene Pulser Xcell TM ）
电穿孔比色皿（Bio-Rad Laboratories，Gene Pulser比色杯，0.4 cm）
荧光显微镜（奥林巴斯，型号：IX53）

软件

GraphPad Prism（GraphPad软件， https://www.graphpad.com/ ）

程序

构建HCV报告系统（VISI系统）细胞系
VISI系统的机制和结构已在我们的研究论文中详细描述（Zhao et al。，2017）。我们的实验室可根据要求提供材料（VISI系统中使用的质粒和细胞系）。
1. 质粒构建
  从技术上讲，大多数记者适用于VISI系统，如绿色荧光蛋白（GFP），红色荧光蛋白（RFP），萤光素酶，抗生素抗性蛋白。在这里，我们选择了两种不同的荧光蛋白：绿色荧光蛋白（GFP，绿色信号）和mCherry（红色信号），用于HCV报告系统构建（VISI-GFP / VISI-mCherry）。将VISI的N / C末端序列分别插入慢病毒载体pWPI-杀稻瘟素或pWPI-嘌呤霉素中。
  注意：上传了这四个DNA序列（Genbank：KY067203 [VISI-GFP的N-末端]，KY067204 [VISI-GFP的C-末端]，KY067205 [VISI-mCherry的N-末端]，KY067206 [ VISI-mCherry的C-terminal]）。
2. 通过慢病毒转导产生Huh7.5.1-VISI
  1. 慢病毒生产
    第1天：
    将1.2×10 6个 293T细胞在完全DMEM中加入6cm培养皿中。
    第2天：
    用4ml新鲜完全DMEM替换培养基并加热磷酸钙（CaPO 4 ）转染溶液（2x HEPES溶液，2.5M氯化钙溶液，无菌H 2 O）。 1-2小时后，稀释15μgDNA（pWPI载体：psPAX2：pMD2.G =6.4μg：6.4μg：2.1μg），终体积为270μl无菌H 2 O，并加入30μl氯化钙溶液（2.5M）。然后轻轻涡旋混合液体并同时逐滴加入2x HEPES溶液（300μl）。最后，将混合物逐滴转移到6厘米的培养皿中，轻轻摇动，使沉淀物均匀分布。
    第3天：
    在磷酸钙转染后16小时，用4ml新鲜的完全DMEM更换培养基。
    第4天：
    在磷酸钙转染后48小时收集上清液（慢病毒），用0.45μm过滤器过滤后，以等分试样储存在-80°C。
  2. 这些慢病毒制剂用于转导靶细胞系Huh7.5.1，其中将5×10 5个细胞接种到6孔板中。转导后8小时，丢弃慢病毒制剂并用新鲜的完全培养基替换。两天后，重悬转导细胞并将其转移到10cm培养皿中。然后在细胞粘附后加入抗生素。
  3. 在用嘌呤霉素（1μg/ ml）和杀稻瘟素（4μg/ ml）选择数天后，将分别成功获得Huh7.5.1-VISI-GFP和Huh7.5.1-VISI-mCherry细胞系。
用于测试细胞间传递的细胞模型的构建
我们选择Huh7.5.1-VISI-mCherry作为用纯化的HCV RNA电穿孔的供体细胞。 Huh7.5.1-VISI-GFP用作可从供体细胞接收病毒基因组的受体细胞。
1. 首先，Huh7.5.1-VISI-mCherry用HCV的体外转录物（Jc1）或亚基因组JFH1（sgJFH1）进行电穿孔，其体外转录自HCV感染性克隆pFK- JC1或亚基因组构建体pFK-sgJFH1（Long et al。，2011）。这两个HCV基因组可以是该实验的阳性和阴性对照。
  1. pFK-JC1和pFK-sgJFH1分别通过限制酶Mlu1或Xba1线性化。
  2. 在室温下组装转录反应（1μg线性化模板，2μl酶混合物，2μlATP溶液，2μlCTP溶液，2μlGTP溶液，2μlUTP溶液，2μl10x反应缓冲液，加入适量无核酸酶加水至20μl），充分混合并在37°C下孵育3小时。
  3. 然后加入1μlDNA酶消化模板，37°C孵育15分钟。
  4. 氯化锂（LiCl）沉淀可用于纯化的转录RNA。加入30μlLiCl沉淀溶液，在-20°C下冷却1小时，然后以最大速度离心15分钟以沉淀RNA。
  5. 用70％乙醇洗涤两次后，用20μl不含RNase的水重悬RNA沉淀。并在-80°C下以10μg等分试样储存。
  6. 添加10μg体外转录物（RNA）与细胞悬液-5 x 10 6 Huh7.5.1-VISI-mCherry细胞重悬浮于400μlcytomix缓冲液中（配方2）。然后使用Bio-Rad Gene Pulser系统和间隙宽度为0.4cm的比色皿（Bio-Rad）通过电穿孔在960mF和270V下转染细胞。电穿孔后立即将细胞重悬于完全DMEM中并根据需要接种。
2. 将电穿孔的Huh7.5.1-VISI-mCherry个体化并与Huh7.5.1-VISI-GFP细胞以1:30的比例混合。
  注意：对于单孔96孔板，需要1,000个Huh7.5.1-VISI-mCherry细胞和30,000个Huh7.5.1-VISI-GFP细胞。
3. 在HCV中和抗体AR3A存在下以50μg/ ml培养细胞以阻断无细胞传播（图1B）。每24小时更换含抗体的培养基。
4. 共培养72-96小时后，可通过捕获荧光图像并检查GFP或mCherry发光细胞的数量来评估HCV细胞间传递效率。
  
  图1. VISI系统和HCV细胞间传播系统的示意图。 A. VISI的N端和C端半部的融合蛋白通过不同的位置信号位于细胞核和线粒体中（核定位信号[NLS]或IPS），分别;在病毒感染后，HCV NS3-4A切割激活C-末端片段从线粒体到细胞核的转运，其中完整的GFP通过分裂内含肽剪接重建。 B.用Huh7.5.1-VISI-mCherry用HCV基因组电穿孔的细胞用作供体细胞;和Huh7.5.1-VISI-GFP细胞用作受体细胞。供体细胞与受体细胞共培养，细胞数比为1:30。为了阻断无细胞传播，我们将HCV中和抗体AR3A添加到上清液中。孵育96小时后，在荧光显微镜下拍摄图像（图2A）。

数据分析

对于实验设计，每个实验有三个重复。对于每个重复，我们捕获10-15个荧光图像，以便计算至少40个病毒灶（图2A）。
对于数据分析，为了评估HCV细胞间传播的效率，我们随机拍摄病毒灶的荧光图像，其中几个红色供体细胞被一些绿色受体细胞包围或不被包围（图2A）。应分别计数红色供体细胞和绿色受体细胞的数量（图2B）。
对于统计分析，我们使用GraphPad Prism通过使用双尾，未配对的学生 t - 测试来分析样本之间的差异。

图2. HCV细胞 - 细胞传递系统的数据处理和分析。 A.共培养96小时后，通过荧光显微镜观察HCV细胞 - 细胞传播现象。供体细胞Huh7.5.1-VISI-mCherry用HCV基因组JC1或亚基因组JFH1（sgJFH1）电穿孔，Huh7.5.1-VISI-GFP细胞用作受体细胞。因此，红色核荧光代表HCV阳性供体细胞，绿色核荧光代表在细胞间传递中感染HCV的受体细胞。 B.计数共培养96小时后每个焦点的HCV阳性供体细胞（Huh7.5.1-VISI-mCherry细胞）或HCV阳性受体细胞（Huh7.5.1-VISI-GFP细胞）的数目。在散点图中，红色圆圈表示每个焦点的HCV阳性供体细胞的数量;绿色方块表示每个病毒灶的HCV阳性受体细胞数;水平线代表40个随机选择的焦点的中位数。

食谱

完成DMEM
DMEM培养基与10％FBS（440ml DMEM + 50ml FBS）混合 1x非必需氨基酸（5毫升）
1x青霉素/链霉素（5 ml青霉素/链霉素）
Cytomix缓冲液，pH 7.6（电穿孔缓冲液）

注意：
1. 用3M水合钾（KOH）将混合物溶液的pH值调节至7.6。通过0.22μm过滤器过滤，并在-20°C下以10 ml等分试样储存。
2. 除非另有说明，否则上述溶液用双蒸水制备。
磷酸钙（CaPO 4 ）转染缓冲液
1. 2.5 M CaCl 2 （在ddH 2 O中），通过0.22μm过滤器过滤，并在-20°C下以10 ml等分试样储存
2. 2x HEPES缓冲液，pH 7.1
  
  注意：将混合溶液的pH值调节至7.1。通过0.22μm过滤器过滤，并在-20°C下以10 ml等分试样储存。
  对于6 cm培养皿中的单磷酸钙（CaPO 4 ）转染，需要270μlddH < sub> 2 O（含有15μgDNA质粒），30μl2.5M Cacl 2 和300μl2xHEPES缓冲液。

致谢

该方案改编自Zhao et al。（2017）中公布的程序。我们感谢F. Chisari提供Huh7.5.1细胞系; M.用于HCV中和抗体AR3A的礼物的法律;和T. Wakita，C。M. Rice，J。Bukh和R. Bartenschlager提供HCV菌株。
中国（2016YFC1200400）的d计划，“100个人才计划”由中国科学院和国家科学与中国的科技部科技重大专项（2014ZX10002002，这项工作是由国家重点的R＆amp支持-001-004和2015CB554300）。作者声明没有利益冲突。

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