材料和试剂

塑料培养皿（Tarsons，目录号：460020-90MM）
50毫升离心管（Tarsons，目录号：546041）
15毫升离心管（Tarsons，目录号：546021）
250毫升锥形瓶（Fisher Scientific，Fisherbrand TM ，目录号：15429103）
培养管（BOROSIL，目录号：9800U08,25 x 150 mm，55 ml），带塑料盖（Tarsons，目录号：020070）
10毫升一次性注射器（Dispo Van，Hindustan Syringes and Medical Devices Limited）
0.22μm注射器过滤器（Sartorius，目录号：16532-K）
显微镜载玻片（Polar Industrial，Blue Star，目录号：PIC-1,75 x 25 mm）
盖玻片（蓝星，22毫米见方，0.13-0.16毫米厚）
移液器吸头（Tarsons，0.2-10μl，目录号：521000;2-200μl，目录号：521010;200-1,000μl，目录号：521020）
接种循环
Kimwipes（Tarsons，目录号：370080,11.17 x 21.3 cm）
无菌手术刀刀片
生物： Ustilago maydis 致病性菌株SG200（Kamper et al。，2006）
酵母提取物粉末（HiMedia Laboratories，目录号：RM027）
蛋白胨，细菌学（HiMedia Laboratories，目录号：RM001）
蔗糖，A.R。（HiMedia Laboratories，目录号：RM3063）
马铃薯葡萄糖肉汤（HiMedia Laboratories，目录号：M403）
D-山梨醇（Sigma-Aldrich，目录号：S1876）
柠檬酸三钠二水合物（Merck，目录号：1.93619.0521）
柠檬酸一水合物（默克，目录号：1.93011.0521）
二水氯化钙（SRL Sisco Research Laboratories，目录号：0344317）
三（羟甲基）氨基甲烷（Merck，Calbiochem，目录号：9210-OP）
Hydrochloric acid about 37% (Merck, catalog number: 1.93001.0521)
Hydrogen peroxide 30% (Merck, catalog number: 1.93007.0521)
Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum(Sigma-Aldrich, catalog number: L1412)
Annexin V-FITC apoptosis detection kit (Sigma-Aldrich, catalog number: APOAF)
YEPSL media (see Recipes)
Potato Dextrose Agar (PD agar) media (see Recipes)
SCS buffer (see Recipes)
Lysing enzymes in SCS (see Recipes)
STC buffer (see Recipes)
10x binding buffer (see Recipes)

Equipment

Pipette (0.5-10 μl, 2-20 μl, 20-200 μl, 100-1,000 μl)
Weighing balance (Shimadzu, model: BL220H)
Shaking incubator
Double beam spectrophotometer (Hitachi High-Technologies, model: U-2910)
Light Microscope (ZEISS, model: Axioskop 40)
Confocal microscope (Leica Microsystems, model: Leica TCS-SP7)
Cold centrifuge (Thermo Fisher Scientific, Thermo ScientificTM, model: Sorvall RC 6 Plus, catalog number: 36-101-0816)
Laminar air flow
Autoclave

Procedure

Growing the fungal cells
1. Day 1: Inoculate 5 ml of YEPSL media (see Recipes) in a culture tube with the U. maydisSG200 strain from a PD-agar plate (take about a loopful of inoculum) and incubate overnight in a shaking incubator at 28 °C and 180 rpm.
  Note: U. maydis usually forms a uniform lawn of cells in the PD agar plate if inoculated in higher density. However, when plated at lower density U. maydis single colonies are quite easily spotted on a PD agar plate.
2. Day 2: Inoculate 50 ml of YEPSL media in a 250 ml conical flask with the overnight grown culture at an OD600 of 0.2 and incubate at 28 °C and 180 rpm. Pellet down the cells by centrifugation in a 50 ml centrifuge tube at 4 °C, 1,070 x gfor 5 min when the OD600 of the culture reaches 0.8 (it usually takes 2.5 to 3 h for the OD600 to reach 0.8).
诱导细胞凋亡（第2天）
将来自前一步骤的沉淀重悬于补充有10mM H 2 O 2 的50ml YEPSL培养基中，并将所得细胞悬浮液在振荡培养箱中于28°温育1小时。 C和180 rpm。
诱导原生质体形成（第2天）
1. 沉淀H 2 O 2 处理的 U。通过将真菌培养物转移到50ml离心管中，然后在4℃，1,070 x g 离心10分钟，将maydis 细胞分离。
2. 弃去上清液，将得到的细胞沉淀重悬于25ml SCS缓冲液中（见食谱），4℃，1070 x g 离心10分钟。
3. 弃去上清液，将沉淀重悬于2 ml SCS缓冲液中，补充12.5 mg / ml裂解酶（见食谱）并在冰上孵育。
4. 在Lysing酶溶液中孵育约10分钟开始监测原生质体形成。每3分钟取一等份细胞，在光学显微镜下以40x放大倍数观察原生质体的形成（图1）。一旦约50％的细胞显示出早期原代质体，就通过向细胞悬浮液中加入10ml SCS缓冲液来终止反应。
5. 将得到的悬浮液在4℃，470 x g 下离心15分钟。
6. 弃去上清液，用10ml SCS缓冲液洗涤含有早期原生质体的沉淀3次，用10ml STC缓冲液洗涤1次（参见配方）每次洗涤10分钟后，在4℃，470 xg离心，10分钟。
  注意：在洗涤步骤中，通过用手轻轻旋转50ml离心管中的细胞悬液，将细胞重悬于SCS / STC缓冲液中;使用移液管和微尖可能会损坏原生质体。
  
  图1. U的光学显微镜图像。与裂解酶一起孵育后的孢子虫。使用的放大倍数是40倍。新兴的原生质体用黑色箭头表示。
用膜联蛋白V-FITC和碘化丙锭染色（第2天）
1. 将前一步骤的沉淀重悬于500μl膜联蛋白V-FITC结合缓冲液中。（通过用高压灭菌的水稀释试剂盒提供的10x结合缓冲液（参见配方6）制备1x结合缓冲液）。此时细胞倾向于结块（图2B和2D）。用无菌手术刀刀片切割1毫升尖端的边缘，以增加边缘的横截面直径。尝试通过使用此尖端向上和向下移取原生质体悬浮液来溶解团块。
  注意：
  1. 尽可能打破团块以确保原生质体均匀染色非常重要。
  2. 原生质体的结块是一个常见的问题，并且已显示结块程度直接取决于诱导原生质体的细胞悬浮液的密度（Wallin等，1974）。去除细胞壁后可能暴露的质膜显示出粘性，因此可以与其他原生质体相互作用，从而形成原生质体聚集体或团块。
2. 向细胞悬液中加入0.5μg/ ml膜联蛋白V-FITC结合物和2μg/ ml碘化丙啶。
  注意：应避免直接接触PI，因为它可能导致皮肤发炎，刺激眼睛和呼吸道。处理PI溶液时，应始终佩戴手套和防护眼镜。
3. 在室温下在黑暗中孵育细胞悬浮液10分钟，然后使用共聚焦显微镜分析细胞。
准备显微镜载玻片（第2天）
1. 通过与kimwipes良好摩擦来清洁载玻片，以清除玻璃表面上的任何污垢颗粒。
2. 将5-6μl细胞悬浮液滴在玻璃表面中间。
3. 小心地将盖玻片放在细胞悬浮液滴上，并使用合适的盖玻片密封剂将其密封到载玻片上。
4. 在共聚焦显微镜下观察。
  
  图2. U的比较视图。原生质体前后的maydis 细胞悬液。 A.含有 U的细胞悬液。原生质体前的maydis 孢子虫; B.原生质体悬浮液（注意由于去除细胞壁而形成的团块）;光盘。（A）和（B）中细胞悬浮液的明视野图像。（C）和（D）的比例尺在图中表示。黄色箭头指向原生质体后注意到的可见细胞团块。

数据分析

U中PS外化的染色。使用annexin V-FITC的maydis 非常不同。在一些情况下，来自FITC的荧光可以主要在原生质体的外围被注意到，这通常在高等真核细胞的PS染色中看到。然而，在 U的情况下，荧光信号的这种外周定位。 maydis 原生质体在整个外围的信号强度方面几乎没有任何均匀性。例如，图3A-3C显示在染色的原生质体周围的特定位置处的单个（A和B）或多个（C）强点。相反，一些染色的原生质体显示完全染色而不是特异性外周染色（图3D-3F）。此外，完全染色并不总是与晚期细胞凋亡相关，其中质膜已经透化并且原生质体缺乏PI染色。然而，也存在这样的情况：可以注意到具有膜联蛋白V-FITC和PI的原生质体的完全染色，表明细胞凋亡的晚期（图4）。在 U中外周FITC染色的情况均不存在。可以看到maydis 原生质体，可以注意到内部PI染色。因此，如果 U中的原生质体。 maydis 染色形式 - 外周染色以及完全染色，可以在凋亡的早期阶段考虑。然而，在细胞凋亡的早期阶段，不应考虑用膜联蛋白V-FITC以及PI显示完全染色的原生质体。这是因为这些原生质体可能代表与原生质体制剂相关的伪影，导致孢子质质膜的损伤以及随后对PI和膜联蛋白V的透化。

图3.膜联蛋白V-FITC染色 U. maydis 原生质体。 A-C。荧光信号的典型外周定位。注意在其他方面均匀染色的周边（黄色箭头）中的单个或多个强点（红色箭头）。 d-F。原生质体完全染色。注意，没有看到离散的外周染色。原生质体边界用虚线标出。比例尺代表4μm。用于可视化FITC和碘化丙啶的荧光的设置列于表1中。

图4. U的双重染色。具有膜联蛋白V-FITC和PI的maydis 原生质体。只有具有完全受损的质膜的原生质体显示来自两种荧光团的荧光信号。双染原生质体用黄色箭头标记。比例尺代表4微米。

表1.用于可视化FITC和碘化丙啶荧光的激光设置

笔记

U中膜联蛋白V-FITC染色的限制步骤。 maydis 是原生质体疾病。只有当原生质体刚刚从细胞壁出来并且没有完全从它们中解离时（第一阶段）或那些刚刚遗漏细胞壁的细胞（STAGE II），细胞最好用标记外化PS的典型外周染色染色。）。我们相信，此时表面拓扑结构和细胞结构的完整性仍然与膜联蛋白V-FITC染色相容。当在原生质体诱导缓冲液中孵育较长时间时，相同的样品显示细胞溶质染色或根本不染色。这些是最后阶段的原生质体，并且与它们各自的细胞壁完全分离了一段时间（第三阶段）（图5）。

图5. U中原生质体形成的不同阶段。 maydis 。 I期和II期代表早期原生质体，而III期代表晚期原生质体，质膜与典型的外周染色大多不相容。尺寸条代表10μm。

食谱

YEPSL媒体
酵母提取物：10克
蛋白胨，细菌学：4克
蔗糖：4克
溶于1,000毫升双蒸水中，在121℃，15磅/平方英寸高压灭菌15分钟
马铃薯葡萄糖琼脂（PD琼脂）培养基
1. 将2.4克马铃薯葡萄糖肉汤溶于双蒸水中，调节至100毫升
2. 向其中加入2g琼脂粉末并在15psi下将所得培养基高压灭菌15分钟
3. 高压灭菌后，将介质冷却至约50℃并进行电镀
SCS缓冲区
1. 向100ml 20mM柠檬酸三钠二水合物中加入D-山梨糖醇至终浓度为1M。
2. 用1M柠檬酸调节pH至5.8，在121℃高压灭菌，15psi，15分钟，并在4℃下储存
SCS中的裂解酶（12.5 mg / ml）
1. 将37.5毫克裂解酶溶于3毫升SCS缓冲液中
2. 将溶液通过0.22μm注射器过滤器并保持在冰上
STC缓冲区
1. 向蒸馏水中的50ml 10mM三（羟甲基）氨基甲烷溶液中加入CaCl 2 至终浓度为100mM，D-山梨糖醇至终浓度为1M。
2. 用37％HCl调节pH至7.5并在121℃，15psi高压灭菌15分钟并在4℃下储存
10x结合缓冲区
100mM HEPES / NaOH，pH 7.5
1.4 M NaCl
25mM CaCl 2，

致谢

这项工作由DST-INSPIRE教师资助IFA13-LSPA16和Bose研究所的研究资助资助。作者感谢Asim Kumar Poddar先生在获取此处提供的共聚焦图像方面提供的帮助。该协议改编自Mukherjee 等人（2017）。

参考

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Kahmann，R。和Kamper，J。（2004）。 Ustilago maydis ：如何它的生物学与病原发展有关。 New Phytol 164（1）：31-42。
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