材料和试剂

50毫升Falcon离心管（TPP Techno Plastic Products，目录号：91050）
无菌注射器过滤器，Filtropur S，0.2μm（SARSTEDT，目录号：83.1826.001）
Slide-A-Lyzer TM 透析盒10 kDA MW截止值，3-12 ml（Thermo Fisher Scientific，目录号：66810）
HiTrap Q HP IEC色谱柱，5 ml（GE Healthcare，目录号：17115401）
Superdex 75 16/60 SEC色谱柱，体积约120 ml（GE Healthcare，目录号：28989333）
Protein LoBind Tubes 1.5 ml（Eppendorf，目录号：0030108116）
96孔板（康宁半面积，黑色和透明平底，非粘合表面）（康宁，目录号：3881）
密封胶带，透明聚烯烃（Thermo Fisher Scientific，目录号：232701）
电子。大肠杆菌 BL21DE3感受态细胞（例如，可从Merck获得，目录号：69450）
pT7-7载体中的α-突触核蛋白（例如，Addgene，目录号：36046）
我们使用该质粒的一个版本，该质粒针对 E进行了密码子优化。大肠杆菌
pACYCduet载体中的NatB（例如，Addgene，目录号：53613）
<异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）> 99％（泛素 - 蛋白酶体生物技术，目录号：P1010-100）
氨苄青霉素钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：A9518）
氯霉素（Sigma-Aldrich，目录号：C0378）
YT中（2x）预混粉末（AppliChem，目录号：A0981）
硫酸镁七水合物 p.a。（默克，目录号：1058860500）
甘油双蒸馏，≥99.5％（VWR，目录号：24388）
三（羟甲基）氨基甲烷，Trizma碱 p.a。（Sigma-Aldrich，目录号：93350）
氯化钠， p.a。（Carl Roth，目录号：3957）
磷酸二氢钠一水合物， p.a。（AppliChem，目录号：131965.1211）
α-突触核蛋白，N-末端乙酰化（来自大肠杆菌中的重组表达 [Johnson et al。，2010]并如所述纯化[Wördehoff et al。，2017]）
注意：我们通过HPLC和质谱验证了N-末端乙酰化。或者，可以进行乙酸凝胶电泳（Iyer等，2016）。我们在本协议的程序部分中简要介绍了我们的α-突触核蛋白纯化方案。
硫磺素T，超纯级（AnaSpec，目录号：AS-88306）
叠氮化钠（ purum p.a。，Sigma-Aldrich，目录号：71290）
H 2 O（Milli-Q≥18.2MΩ电阻率）
玻璃珠，直径2.85-3.45毫米（Carl Roth，目录号：A557.1），储存于70％乙醇中以确保无菌状态
磷酸二氢钾（ p.a。，AppliChem，目录号：A1043）
磷酸氢二钾，三水合物（ p.a。，Merck，目录号：105099）
氯化钾（ p.a。，Carl Roth，目录号：6781.1）
盐酸， p.a。≥37％（Sigma-Aldrich，目录号：30721-M）
硫酸铵，puriss。 p.a。≥99％（默克，目录号：31119-M）
改良的2YT培养基（见食谱）
10x中等缓冲液，pH 7.2（见食谱）
IEC缓冲区A（见食谱）
IEC缓冲B（见食谱）
饱和硫酸铵溶液（见食谱）
SEC缓冲区（见食谱）

设备

移液器（例如，Eppendorf，型号：Research ® Plus，目录号：3123000039,3123000055,3123000063）
无菌镊子
-80°C冰柜
荧光板读数器（例如，BMG LABTECH，型号：FLUOstar Omega），配有单色仪或适用于荧光团硫磺素T的滤光片（例如，BMG激发滤光片：448（nm））-10，BMG发射滤光片：482（nm）-10）
读板器应可加热至37°C
UV / VIS分光光度计（例如，JASCO，型号：V-650）
加热块（例如，Grant Instruments，型号：UBD2）
磁力搅拌器（例如，Cole-Parmer仪器，Stuart，型号：CB161）
离心50 ml Falcons（例如，Eppendorf，型号：5804 R）
ÄKTA净化器（GE Healthcare）

软件

Microsoft Excel
AmyloFit（ http://www.amylofit.ch.cam.ac.uk/ ）

程序

乙酰化α-突触核蛋白的纯化
在这里，我们简要描述了我们如何纯化我们的乙酰化α-突触核蛋白，如Wördehoff et al。，2017所述。由于该协议主要关注由硫磺素T荧光监测的α-突触核蛋白的聚集，纯化是尽可能简洁地描述。
1. 我们共同表达pT7-7载体中的密码子优化的α-突触核蛋白，以及来自 Schizosaccharomyzes pombe 的含有N-末端乙酰化酶NatB的载体pNatB，如Johnson 等所述。，2010。
2. 表达在 E中进行。大肠杆菌BL21DE3在2YT培养基中生长，培养基中添加50 mM K /磷酸钠缓冲液pH 7.2,2 mM MgSO 4 和0.4％甘油（v / v），含100μg/ ml氨苄青霉素和35μg/ ml氯霉素作为选择标记。我们从甘油原液中接种（预）培养物，该甘油原液是通过在2YT培养基中过夜生长单个菌落，与50％甘油（无菌）混合制备的，并在-80℃下储存。
3. 预生长至1-1.2的OD 600 后，通过加入1mM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达，并在37℃下以120rpm振荡孵育4小时。。我们经常准备500毫升培养物，这使我们的最终表达产量为~25毫克乙酰化α-突触核蛋白。
4. 通过在4,000℃下以6,000 x g 离心15分钟收获细胞。
5. 将单个细胞沉淀（来自500ml培养物）重悬于15ml纯H 2 O中，并在-20℃下在50ml Falcon管中冷冻。
6. 将具有冷冻细胞悬浮液的Falcon管转移至预热至98℃的加热块中并孵育30分钟以裂解细胞并通过热变性沉淀蛋白质。 α-突触核蛋白是热稳定的并且保持可溶性。
7. 将细胞裂解物在冰上冷却10分钟，然后将细胞碎片和沉淀的蛋白质在15,000 x g 和4℃下沉淀30分钟。
8. 然后将上清液通过0.2μm过滤器过滤到新的50ml管中。
9. 将饱和硫酸铵溶液（室温下~4.3M）以1ml步骤加入上清液至50％饱和度（1：1），同时在磁力搅拌器上搅拌，从而沉淀α-突触核蛋白，核酸基本上保持可溶。
10. 然后将混浊的溶液在冰上孵育20分钟，并在15,000 x g 和4℃下沉淀30分钟。
11. 弃去上清液，将沉淀重悬于50ml IEC缓冲液A中（任选：溶于5ml IEC缓冲液A中，对1L IEC缓冲液A透析过夜）。
12. 然后将该溶液加载到连接到ÄKTA净化器系统（GE Healthcare）的5ml HiTrap Q HP离子交换色谱柱（GE Healthcare）上，在IEC缓冲液A中平衡。
13. α-突触核蛋白在0-500mM NaCl梯度下以约250mM NaCl洗脱至IEC缓冲液B，以2.5ml / min运行超过100ml。
14. 合并含有α-突触核蛋白的级分，再次通过硫酸铵沉淀并如上所述沉淀。
15. 将沉淀重悬浮于4ml SEC缓冲液中，最后通过尺寸排阻色谱（SEC）在Superdex 75 16/60柱（120ml柱体积，GE Healthcare）上以1ml / min在SEC缓冲液中进行两次纯化。
16. SEC后，通过0.2μm过滤器对α-突触核蛋白进行无菌过滤，并在分光光度计上测量浓度，使用和消光系数为5,600 M -1 cm -1 在275纳米。
17. 将α-突触核蛋白等分，在液氮中快速冷冻并储存在-80℃。
一般准备
1. 制备储备溶液：在H 2 O中的1mM硫磺素T，在H 2 O中的10％（w / v）叠氮化钠。我们使用硫磺素T溶液一年;每月新鲜制备叠氮化钠溶液（均在4-8°C的冰箱中保存）。
2. 缓冲液和蛋白质溶液应过滤灭菌。由于α-突触核蛋白对降解敏感，α-突触核蛋白的等分试样应储存在-80°C并在试验前解冻。
3. 计算移液器的试剂量。对于一式三份测量，每种条件需要400μl样品（3x120μl，40μl储备）。为了避免在达到原纤维形成平衡之前ThT荧光饱和，应该使用所施加的蛋白质浓度的足够高的ThT浓度。我们通常使用10-20μMThT和0.05％叠氮化钠（最终浓度）。
4. 包括阴性对照，由缓冲液，盐，硫磺素T和叠氮化钠组成。
5. 将读板器预热至37°C。聚集测定可以在不同的温度下进行，例如，例如，在20℃和37℃之间。然而，我们常规使用37°C，因为它是人体温度，并且在较低温度下α-突触核蛋白聚集非常慢。
6. 准备好培养皿：用无菌镊子，取出所需数量的玻璃珠（从70％乙醇溶液中取出），在无绒布上快速干燥，然后将它们转移到孔中 - 选择同质大小的玻璃珠。由于我们使用的玻璃珠在尺寸和形状方面略微不均匀，我们挑选出具有小直径和大直径的玻璃珠，以及通过目视检查不是球形的玻璃珠。通常，添加玻璃珠对于加速聚集和提高一式三份的再现性至关重要。
7. 我们总是将板的外孔留空;他们可以给出意想不到的读数，所以首先使用的是B2，最后好的是G11。
8. 可选：移取120μl水进入井和空闲井之间的空间 - 这样做可以最大限度地减少样品井中可能的蒸发。
9. 准备并标记足够量的1.5ml蛋白质低结合反应管并将管转移到冰上，在冰上进行随后的移液步骤。
样品制备
1. 移取试剂，从缓冲液开始，然后用叠氮化钠，硫磺素T，最后将蛋白质溶液移入1.5ml反应管中。例如，这是图1中所示的400μl50μMα-突触核蛋白样品的移液方案，假设α-突触核蛋白，1 mM硫磺素T和10％叠氮化钠的原液浓度为200μM：
  1. 294μl的SEC缓冲液
  2. 2μl10％叠氮化钠
  3. 4μl的1mM硫磺素T
  4. 100μlα-突触核蛋白（在SEC缓冲液中）＆nbsp;
2. 不久（1秒）将样品涡旋混合，然后将它们放回冰上。
3. 每孔分配120μl样品。
4. 用密封胶带密封板并将其转移到读板器上。
读板设置
1. 我们使用荧光板读数器（BMU LABTECH的FLUOstar Omega），测定温度：37°C。
2. 基本参数：微孔板：Greiner 96半面积;励磁过滤器：448-10;发射滤光片：482-10;收益：750;轨道平均开：3毫米，底部光学，稳定时间：1秒;动力学窗口：1,000次循环，每孔12次闪烁和循环，循环时间：900秒。
3. 布局：标记样品的分布。
4. 摇动选项：轨道，400 rpm，每个循环前30秒。摇动对于加速聚合和提高一式三份的再现性至关重要。
5. 样品运行直至达到荧光平台。
6. 有关读板设置，另请参阅附录。

数据分析

本节应指导读者完成数据分析。我们已经包括两个示例性的α-突触核蛋白聚集测定，第一个显示不同浓度的α-突触核蛋白聚集（图1），第二个显示聚集抑制剂（二酪氨酸交联的α-突触核蛋白）的影响，改编自Wördehoff et al。，2017（图2）。

测定后，我们首先计算阴性对照一式三份的平均值，即，我们缓冲液中硫磺素T的背景荧光，并在给定时间减去每个样品一式三份的平均背景荧光在Microsoft Excel中指向例如。与阴性对照相反，样本不是平均值，并且在图中显示为三次。
可以使用AmyloFit Aggregation Fitter工具在线完成聚合数据的评估（ http：// www .amylofit.ch.cam.ac.uk / ）。 AmyloFit可以根据淀粉样蛋白聚集的最新数学模型拟合聚合数据并提取聚集的动力学和机械参数（Meisl et al。，2016）。如果在所应用的实验条件下根据任何这些模型进行聚集，并且当准确且全局拟合时，可以提取诸如一级/二级成核速率常数和伸长率常数的参数（Cohen 等人， 2013）。
例如，我们监测了四种不同浓度的α-突触核蛋白的聚集，并用AmyloFit评估了数据（图1）。
数据被导出到以制表符分隔的文本文件中，第一列是时间轨迹，另一列是荧光痕迹。
作为第一步，绘制原始数据（见图1A）。
数据在Amylofit软件中标准化（图1B）。这通过在测定结束时选择荧光平台中的数据点（或一系列数据点）来完成，其中（或其平均值）被设置为1并且所有其他值相应地缩放。在图1B的情况下，80小时后（对于25μM至100μMα-突触核蛋白）或90小时（对于10μMα-突触核蛋白）的荧光强度用于标准化。
下一步是绘制聚集半衰期与初始单体浓度（ m0 ）的关系，以提取比例指数，从而深入了解哪些聚合机制占主导地位（图1C）。注意，可以观察到双对数图中的非线性行为，指示随着蛋白质浓度增加主要生长机制的变化（Meisl 等人，2016）。选择主导聚合模型的选择流程图可以在Meisl 等人的出版物的补充信息中找到。，2016。

图1.通过ThT荧光研究的α-突触核蛋白的聚集动力学在10μM硫磺素T存在下聚集的四种浓度的α-突触核蛋白（10μM，25μM，50μM和100μM）和在SEC缓冲液中的0.05％叠氮化钠，一式三份测量。该试验已通过AmyloFit软件（ http://www.amylofit.ch.cam）进行评估。 ac.uk ）。 A.原始数据，四种浓度的三次测量的绝对ThT荧光读数; B.四种浓度的归一化聚集数据; C.双对数半时间图（log（ m0 ）：初始单体浓度vs log（τ）：聚合半衰期。
比例指数为-0.26，反映了在中性pH下α-突触核蛋白聚集的低单体浓度依赖性。这表明在这些实验条件下，机制是活性的，限制了单体浓度依赖性，例如饱和原纤维伸长率（Meisl 等。，2016; Buell et al。，2014 ），原纤维碎裂（Shvadchak et al。，2015），以及空气 - 水界面的成核（Campioni et al。，2014），可能会被蛋白质饱和（Pham et al。，2016）。
该测定还可用于鉴定干扰α-突触核蛋白聚集的分子。
例如，我们在不存在和存在二酪氨酸（DiY） - 交联的α-突触核蛋白的情况下监测α-突触核蛋白的聚集（Wördehoff等人，，2017）（图2A）。 >
必须注意的是，降低的ThT荧光强度并不一定意味着聚集被抑制，因为抑制剂也可以与ThT相互作用，阻碍原纤维上的ThT结合位点和/或改变聚集体的形态，使得ThT不再结合（ Jameson et al。，2012）。
为了补充我们的ThT数据，我们因此在测定后收集含有和不含抑制剂的样品，并进行尺寸排阻色谱以证实α-突触核蛋白在抑制剂（DiYα-突触核蛋白）存在下保持单体（图2B）。 />

图2.在抑制剂存在下α-突触核蛋白的聚集动力学。25μMα-突触核蛋白与（蓝色）和不含（灰色）25μM二酪氨酸（DiY） - 交联的α-突触核蛋白聚集在一起在SEC缓冲液中的μM硫磺素T和0.05％叠氮化钠，一式三份测量。 A.含有和不含抑制剂的三次测量的ThT荧光读数。 B.在有和没有抑制剂的聚集测定之前和之后采集的样品的尺寸排阻色谱。注意，在存在抑制剂的情况下，聚集后的单体峰同样高，而在没有抑制剂的情况下其显着降低。

食谱

改良2YT培养基（1L）
31克YT中（2x）预混粉末
2 mM MgSO 4
0.4％甘油（v / v）
溶解并混合约950毫升Milli-Q H 2 O和高压灭菌器
高压灭菌后，将900ml培养基与100ml 10x培养基缓冲液混合在室温下储存
10x中等缓冲液，pH 7.2（1 l）

最终集中
1升

360 mM K 2 HPO 4
82.16 g K 2 HPO 4 ·3H 2 O

140mM NaH 2 PO 4
19.32 g NaH 2 PO 4 ·H 2 O

溶于Milli-Q H 2 O和高压灭菌器中在室温下储存
IEC缓冲液A（50 mM Tris-HCl pH 8，500 ml）
50mM三（羟甲基）氨基甲烷
将3.03g三（羟甲基）氨基甲烷溶于400ml Milli-Q H 2 O中，用HCl滴定至pH8，用Milli-Q H 2 O调节至500ml
在室温下储存
IEC缓冲液B（50 mM Tris-HCl pH 8,800 mM NaCl，500 ml）

最终集中
适用于500毫升

50mM三（羟甲基）氨基甲烷
3.03克

800 mM NaCl
23.38克NaCl

溶于400 ml Milli-Q H 2 O，用HCl滴定至pH 8，用Milli-Q H 2 O调节至500 ml
在室温下储存
饱和硫酸铵溶液（250毫升）
4.3 M硫酸铵
在Milli-Q H 2 O中溶解142.05 g（NH 4 ） 2 SO 4 并调节体积用Milli-Q H 2 O至250ml并在室温下储存
SEC缓冲液（1 L）

最终集中
1升

20mM K 2 HPO 4
4.56克K 2 HPO 4 ·3H 2 O

5mM KH 2 PO 4
0.68克KH 2 PO 4

100 mM KCl
7.46克KCl

溶于Milli-Q H 2 O并过滤灭菌
缓冲液储存在室温下

致谢

该方法改编自Wördehoff等人（2017）。质粒pNatB（pACYCduet-naa20-naa25）是来自Dan Mulvihill的礼物（Addgene质粒No.53613）。该项目已获得欧洲研究理事会根据欧盟“地平线2020”研究和创新计划，第726368号赠款协议提供的资金。作者声明不存在竞争利益。

参考

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