材料和试剂

Ca 2+指示剂染料Fura-2-乙酰氧基甲基酯（Fura-2AM）（Molecular Probes）
酚红无色DMEM
NaHCO 3

设备

25毫米圆形玻璃盖片
附带背面薄型CCD冷却数码相机（ORCAII BT; Hamamatsu Photonics）的Nikon Eclipse TE200-E显微镜

软件

MetaFluor软件（Imaging Corp）

程序

将50000个CHO-K1细胞/ml板置于25mm圆形玻璃盖玻片上24小时
用2.5μM的Ca 2+指示剂染料Fura-2AM（Molecular Probes）在含有20mM NaHCO 3（pH 7.4）的无酚红DMEM中加载细胞，。
在37℃孵育30分钟。
用无酚红DMEM洗涤并在含有20mM NaHCO 3（pH 7.4）的无酚红DMEM中孵育15分钟（以允许酯基水解）。
将圆玻璃盖玻片与细胞放在Nikon Eclipse TE200-E显微镜的镜台上
加入300μl含有20mM NaHCO 3（pH 7.4）的不含酚红的DMEM。
本地化要记录的单元格（尽可能多），并使用MetaFluor软件将其标记为2-3个背景区域。
在曝光期间在交替的340和380nm光束下获取装载的细胞在x40油浸物镜下的图像，并且每5秒测量505nm处的光发射强度。
在基线稳定的30-40秒后，添加其效果需要证实的治疗（300μl），然后继续记录。
使用MetaFluor软件记录治疗施用后[Ca 2+ 2 +]/- 的变化作为相应激发波长（F340/F380）的背景底物比例。

致谢

该协议改编自Cordoba-Chacon等人（2010）; Cordoba-Chacon等人（2011）和Duran-Prado等人（2012）。

参考文献

Cordoba-Chacon，J.，Gahete，M.D.，Duran-Prado，M.，Pozo-Salas， Malagon，M.M.，Gracia-Navarro，F.，Kineman，R.D.，Luque，R.M Castano，J.P。（2010）。在啮齿动物中生长抑素受体亚型5的新功能性截短变体的鉴定和表征。 em> Cell Mol Life Sci 67（7）：1147-1163。
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