材料和试剂

聚苯乙烯培养皿92 x 16 mm带通风凸轮（SARSTEDT，目录号：82.1473.001）
画笔，Marabu通用圆形1号或类似（Marabu，目录号：4007751346186）
方格纸（0.2 cm 2 网格）（LANDRÉ，目录号：100050441或类似）
各种菌株的三龄幼虫（例如， w 1118 ，BL3605）
自来水

设备

QuickMist TM 喷雾瓶（Dynamo，目录号：605144）
立体显微镜（ZEISS，型号：Stemi 2000-C），附带光源（SCHOTT，型号：KL 200 LED）
佳能EOS 1000D（佳能，型号：EOS 1000D）（或具有可连接显微镜管和视频功能的类似相机。或者，任何能够在5-10厘米的距离范围内聚焦物体并具有视频功能的数码相机都是合适的。三脚架或复制站应在手边）

软件

FIJI 2.0.0（Schindelin et al。，2012）或ImageJ 2.0.0（Rueden et al。，2017）
GraphPad Prism 5（＆copy; GraphPad软件）或具有散点图或箱形图工具的可比较软件（统计计算R项目，R核心团队（2013））

程序

将空培养皿置于立体显微镜下的一张方格纸上。
将相机连接到立体显微镜并调整所有设置，使培养皿聚焦在相机上（图1A）。
用喷雾瓶中的自来水洒上培养皿表面，以阻止幼虫粘到干燥的表面并开始化蛹。非常薄的水膜就足够了。避免用水淹没培养皿。
使用湿漆刷将第三龄幼虫从其小瓶转移到培养皿中间（图1B）。

图1.实验设置和数据表示。 A.实验设置。 Camecoora连接到立体显微镜，培养皿放在下面。 B.加湿培养皿中的第三龄幼虫。底层的方格纸清晰可见。 C.通过GraphPad Prism（＆copy; GraphPad软件）获取的采集数据的图形输出。
启动视频并继续拍摄，直到幼虫连续爬行至少10秒而不会翻滚，停止或转动（见视频1）。这并不总是立即发生。使用湿的画笔，您可能不时需要将幼虫移回焦点。如果幼虫爬行时间较短，可能无法达到最大连续速度，因此应丢弃所有较短时间段的测量值。

视频1
重复，直到达到所需的n。

数据分析

用FIJI或ImageJ（Rueden et al。，2017）打开录制的视频，并记录幼虫在一条直线上爬行的10秒时间框架的第一个和最后一秒。
在10秒窗口的开始和结束时标记幼虫的末端。
使用可见方格纸计算爬行距离。
计算同一时间范围内的身体收缩次数。
通过将爬行距离除以收缩次数，您可以计算出每只动物的每次收缩距离。
将所有计算值导入GraphPad Prism，并使用散点图或箱形图工具以图形方式显示它们。这种类型的图表最能说明哪些数据集在平均值之内或之上/之下（图1C）。

笔记

只收集相同年龄的动物（例如，已经让苍蝇食物在小瓶内向上爬行的三龄游荡幼虫），以便在个体动物之间获得更好的再现性。此外，重要的是，飞行小瓶不会过多，因为由于食物竞争，过度拥挤的小瓶中的幼虫往往较小。
还请注意立体显微镜的照明，取决于光源，会产生热量并可能导致培养皿中自来水的蒸发。因此，您可能需要在实验过程中补充培养皿内的水膜。实验在室温下进行。请记住，温度差异可能会影响爬行行为，因此所有实验都应在类似条件下进行。建议使用连接到立体显微镜的相机，因为它还可以比标准的宏观设备更容易地测量第一龄或第二龄幼虫的运动。

致谢

我们要感谢Mareike Panz，Benjamin Hallier，Ronja Schiemann和Heiko Harten对这种方法的初步实验。我们还要感谢Caldwell et al。（2003）和Nichols et al。（2012），他们发布了此方法的早期版本和SFB 944以获得资助。在该研究中使用从Bloomington Drosophila Stock Center（NIH P40OD018537）获得的股票。所有作者都声明没有相互冲突或相互竞争的利益。

参考

Caldwell，J.C.，Miller，M.M.，Wing，S.，Soll，D.R。和Eberl，D.F。（2003）。动态分析果蝇 chordotonal器官突变体中的幼虫运动。 Proc Natl Acad Sci USA 100（26）：16053-16058。
Demerec，M。（1950）。果蝇的生物学。威利＆amp; Sons，Inc。纽约。
Nichols，C。D.，Becnel，J。和Pandey，U。B.（2012）。测定果蝇行为的方法。 J Vis Exp （61）。
R核心团队（2013年）。 R：统计计算的语言和环境。 R统计计算基金会，奥地利维也纳。
Risse，B.，Otto，N.，Berh，D.，Xiaoyi，J.，Kiel，M。和Klambt，C。（2017）。 FIM2c：用于操纵和分析动物行为的多色多功能成像系统。 IEEE Trans Biomed Eng 64（3）：610-620。
Rotstein，B.，Post，Y.，Reinhardt，M.，Lammers，K.，Buhr，A.，Heinisch，J.J.，Meyer，H。和Paululat，A。（2018）。基质细胞蛋白中的不同结构域孤独的心脏对于果蝇。 J Biol Chem 293（20），pp.7864-7879。
Rueden，C.T.，Schindelin，J.，Hiner，M.C.，DeZonia，B.E.，Walter，A.E.，Arena，E.T。和Eliceiri，K.W。（2017）。 ImageJ2：ImageJ用于下一代科学图像数据。 BMC生物信息学 18（1）：529。
Schindelin，J.，Arganda-Carreras，I.，Frize，E.，Kaynig，V.，Longair，M.，Pietzsch，T.，Preibisch，S.，Rueden，C.，Saalfeld，S.，Schmid，B 。，Tinevez，JY，White，DJ，Hartenstein，V.，Eliceiri，K.，Tomancak，P。和Cardona，A。（2012）。斐济：生物图像分析的开源平台。 Nat方法 9（7）：676-682。