材料和试剂

耗材
1. 无菌移液器吸头
2. 牙签
3. 60毫米x 15毫米圆形培养皿
主管细胞
电子。大肠杆菌感受态细胞例如，One Shot TOP10化学感受器 E.大肠杆菌（赛默飞世尔科技，目录号：C404010）
质粒和双链DNA
1. pCas9_sgRNA_0（Addgene，目录号：70763或根据要求提供）（图1A）
2. pMS73（Addgene，目录号：110629或根据要求提供）（图1B）
3. 双链DNA片段可以购买例如，gBlocks（Integrated DNA Technologies）或GeneStrands（Eurofins Genomics）
寡核苷酸10pmol /μl
1. oMS59：5'ATTCGTGATTTACACCAAACACGC 3'
2. oMS49：5'CCCCTCGTCTCGCGCCTCATTGGTCGAATTG 3'
3. oSR224：5'CTACACTCAGCACACGATGT 3'
酶和缓冲液
1. Acc65I限制性内切核酸酶（New England Biolabs，目录号：R0599S）
2. Gibson Assembly ®主混合物（New England Biolabs，目录号：E2611S）
3. Phusion High-Fidelity DNA Polymerase（New England Biolabs，目录号：M0530S）或BioMix Red（Bioline，目录号：BIO-25006）
套件
1. QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN，目录号：27104）
2. Wizard SV Gel和PCR Clean-Up系统（Promega，目录号：A9281）
3. 可选：Plate Seq Kit PCR（Eurofins基因组学）
抗生素
1. Milli-Q水中的氨苄西林10 mg / ml原液（Carl Roth，目录号：HP62.1）
2. Carboxin 5 mg / ml甲醇储备（Sigma-Aldrich，目录号：45371）
试剂
1. 胰蛋白胨（BD Biosciences）
2. 酵母提取物（BD Biosciences）
3. 氯化钠（NaCl）
4. 蛋白胨（BD Biosciences）
5. 蔗糖（BD Biosciences）
6. 山梨糖醇（Sigma-Aldrich，目录号：S1876）
7. Bacto琼脂（BD Biosciences）
8. 马铃薯葡萄糖肉汤（BD Biosciences）
媒体（见食谱）
1. 酵母提取物胰蛋白胨（dYT）液体培养基+100μg/ ml氨苄青霉素
2. YT琼脂平板+100μg/ ml氨苄青霉素
3. YEPS轻液体培养基+/-2μg/ ml carboxin
4. 两层再生琼脂灯（RegAgar）板（底层（10毫升），含4微克/毫升羧基和顶层（10毫升），不含羧基（准备新鲜））
5. 马铃薯葡萄糖（PD）琼脂平板+/-2μg/ ml羧基
注意：所有介质都需要高压灭菌。对于平板，每个培养皿应使用20毫升培养基。

设备

注意：不需要特定制造商的设备。可以使用任何等效设备。

移液器
可上网的电脑
平板培养箱（28°C，37°C）
振荡器（28°C，37°C）
ThermoMixer（例如，Eppendorf，型号：ThermoMixer ® C，目录号：5382000015）
热循环仪（例如，Analytik，Jena，Biometra，目录号：846-2-070-301）
台式离心机（例如，Thermo Fisher Scientific，目录号：75008801）

软件

不需要特定的软件。可以使用任何适当的对准程序，如CloneManager 9 Professional Edition（科学和教育软件）或CLC Main Workbench（QIAGEN）。

程序

使用E-CRISP选择目标序列（Heigwer et al。，2014）
注意：尽管已经为sgRNA设计开发了几种工具，但我们的经验仅限于被证明非常可靠的E-CRISP工具。
1. 选择 U. maydis 作为E-CRISP网页中的有机体（ http：//www.e -crisp.org/E-CRISP/ ）。
2. 单击“输入目标序列”框并以FASTA格式插入目标基因组DNA序列。
  注意：使用您想要失活的基因的编码序列并将搜索限制在基因的最5'端。如果您没有找到合适的sgRNA，您可以将输入序列扩展到3'端。
3. 点击“启动应用程序”面板上的“显示高级选项”，确保3'PAM为NGG。
  注意：
  1. E-CRISP工具提供了将靶序列的搜索限制为以G开头的序列。但是，当使用我们的质粒骨架时，这种限制是不必要的，因为我们的线性化质粒在3'末端保留了G突出端。 U6启动子作为第一个G优先启动U6启动子的转录。
  2. E-CRISP工具为您提供了设计截断目标序列的选项（Fu et al。，2014）。我们通常使用20nt的靶序列，但是使用短至18nt的靶序列已经成功。
4. 点击“开始sgRNA搜索”。
5. 选择分数最高且基因中最多5'的靶序列。仔细检查目标基因是否与您想要破坏的基因相对应。
按照表1中的实例设计sgRNA表达盒并将其插入pCas9_sgRNA_0或pMS73（图1）
注意：开发用于U. maydis的基因组编辑的CRISPR-Cas9质粒赋予大肠杆菌中的氨苄青霉素抗性和U. maydis中的羧resistance抗性。这些质粒含有用于自主复制的U. maydis ARS元件（Tsukuda等，1988）。质粒主链也在Acc65I位点之前含有U. maydis U6启动子，用于通过Gibson Assembly >（图1）。密码子优化的Cas9的表达由pCas9_sgRNA_0中的组成型otef启动子（图1A）或pMS73中的更强的hsp70启动子驱动（图1B）。

图1. CRISPR-Cas9质粒的方案和克隆策略。 A.pCas9_sgRNA_0的示意图和用于引入单个sgRNA的克隆策略。可以通过Gibson Assembly ®将用户定义的靶向片段克隆到Acc65I线性化的pCas9_sgRNA_0骨架中。 B.pMS73的示意图和用于引入两个或更多个sgRNA表达盒的克隆策略。用户定义的左右边界盒和可变数量的中间盒可以通过Gibson Assembly ®克隆到Acc65I线性化的pMS73骨架中。靶序列用作Gibson突出端，并且可以根据需要插入的靶序列的数量修改中间盒的数量。 ori：复制起点，bla：β-内酰胺酶基因，赋予 E中氨苄青霉素抗性。大肠杆菌，ARS：在 U中自主复制序列以进行复制。 maydis ，ip R ： U. maydis ip allele赋予对carboxin的抗性。黄色框中的数字表示不同的靶向序列。支架序列对应于Cas9结合所需的最小支架（Hsu 等人，，2013）。用于驱动不同sgRNA表达的tRNA启动子由不同颜色的箭头指示。青色线表示Gibson突出到P U6 。绿线表示Gibson突出到P otef 。紫色线表示Gibson突出到P hsp70 。
1. 在适当的模板中引入您的目标序列（表1）。
2. 将设计的序列购买为双链DNA片段。
  注意：购买sgRNA表达盒的替代方法是通过模板PCR扩增产生它们。您可以使用双链DNA片段作为此类PCR的模板。
  
  表1.用于生成含有目标靶序列的双链DNA片段的模板
  
  表1.续
  
  *表1中的颜色与图1中的颜色相对应。
  **支架序列对应于Cas9结合所需的最小支架（Hsu et al 。，2013）。
  
  注意：标记为tRNA启动子的序列包含最终在成熟tRNA中的tRNA的DNA序列和编码成熟tRNA的部分上游100bp。
通过Gibson Assembly 将sgRNA表达盒克隆到CRISPR质粒中（Gibson et al。，2010）
1. 用Acc65I线性化pCas9_sgRNA_0或pMS73。
2. 根据制造商的方案，通过GibsonAssembly®将sgRNA表达盒克隆到骨架中。
  注意，我们使用了Gibson Assembly ® Master Mix（使用手册，NEB＃E2611S / L 10/50反应，版本4.0））。
3. 将Gibson Assembly ®反应的一部分转化为有能力的 E。根据制造商的方案选择大肠杆菌细胞，并选择在含有100μg/ ml氨苄青霉素的YT平板上生长。将选择板在37°C孵育过夜。
  注意：我们使用了热休克大肠杆菌转化方案（细菌转化工作流程 - 4个主要步骤）在Thermo Fischer网站上给出。
4. 选择一些菌落以检查sgRNA表达盒的正确插入。使用无菌移液管尖或牙签将单个菌落接种到3 ml含有100μg/ ml氨苄青霉素的dYT培养基中。在37°C振荡孵育过夜。
5. 根据制造商的说明，使用例如QIAprep spin miniprep试剂盒从细菌培养物中分离质粒DNA。
6. 通过限制性分析和测序测试具有插入物的质粒。
注意：图1. CRISPR-Cas9质粒的方案和克隆策略。 A.pCas9_sgRNA_0的示意图和用于引入单个sgRNA的克隆策略。可以通过Gibson Assembly ®将用户定义的靶向片段克隆到Acc65I线性化的pCas9_sgRNA_0骨架中。 B.pMS73的示意图和用于引入两个或更多个sgRNA表达盒的克隆策略。用户定义的左右边界盒和可变数量的中间盒可以通过Gibson Assembly ®克隆到Acc65I线性化的pMS73骨架中。靶序列用作Gibson突出端，并且可以根据需要插入的靶序列的数量修改中间盒的数量。 ori：复制起点，bla：β-内酰胺酶基因，赋予 E中氨苄青霉素抗性。大肠杆菌，ARS：在 U中自主复制序列以进行复制。 maydis ，ip R ： U. maydis ip allele赋予对carboxin的抗性。黄色框中的数字表示不同的靶向序列。支架序列对应于Cas9结合所需的最小支架（Hsu 等人，，2013）。用于驱动不同sgRNA表达的tRNA启动子由不同颜色的箭头指示。青色线表示Gibson突出到P U6 。绿线表示Gibson突出到P otef 。紫色线表示Gibson突出到P hsp70 。
1. 在适当的模板中引入您的目标序列（表1）。
2. 将设计的序列购买为双链DNA片段。
  注意：购买sgRNA表达盒的替代方法是通过模板PCR扩增产生它们。您可以使用双链DNA片段作为此类PCR的模板。
  
  表1.用于生成含有目标靶序列的双链DNA片段的模板
  
  表1.续
  
  *表1中的颜色与图1中的颜色相对应。
  **支架序列对应于Cas9结合所需的最小支架（Hsu et al 。，2013）。
  
  注意：标记为tRNA启动子的序列包含最终在成熟tRNA中的tRNA的DNA序列和编码成熟tRNA的部分上游100bp。
通过Gibson Assembly 将sgRNA表达盒克隆到CRISPR质粒中（Gibson et al。，2010）
1. 用Acc65I线性化pCas9_sgRNA_0或pMS73。
2. 根据制造商的方案，通过GibsonAssembly®将sgRNA表达盒克隆到骨架中。
  注意，我们使用了Gibson Assembly ® Master Mix（使用手册，NEB＃E2611S / L 10/50反应，版本4.0））。
3. 将Gibson Assembly ®反应的一部分转化为有能力的 E。根据制造商的方案选择大肠杆菌细胞，并选择在含有100μg/ ml氨苄青霉素的YT平板上生长。将选择板在37°C孵育过夜。
  注意：我们使用了热休克大肠杆菌转化方案（细菌转化工作流程 - 4个主要步骤）在Thermo Fischer网站上给出。
4. 选择一些菌落以检查sgRNA表达盒的正确插入。使用无菌移液管尖或牙签将单个菌落接种到3 ml含有100μg/ ml氨苄青霉素的dYT培养基中。在37°C振荡孵育过夜。
5. 根据制造商的说明，使用例如QIAprep spin miniprep试剂盒从细菌培养物中分离质粒DNA。
6. 通过限制性分析和测序测试具有插入物的质粒。
注意：...
在此步骤中，您可以通过将PD-carboxin平板上的单个菌落平行复制平板来确认CRISPR-Cas9质粒的丢失（参见步骤8）以产生主板并从主板中选择那些菌落。不能在carboxin板上生长的盘子。

图2.含有要测试的菌落的主板的实例。建议生成主板以促进筛选过程。单个菌落来自个体 U.将maydis 转化体按照网格图案转移到新的PD板上，并用数字标记以进行鉴定。用扁平牙签进行转移，将细胞置于网格正方形的中心并稍微扩展以增加细胞可以长大并形成菌落的区域。 A.孵化前的主板; B.在28℃温育过夜后制成平板。

基于菌落PCR的筛选用于CRISPR-Cas9诱导的突变

设计引物，能够扩增含有靶位点的约500bp的PCR产物。
使用无菌移液管尖或牙签，从主板上取少量菌落（步骤6c），并将其置于含有20μl20mM NaOH的96孔板的孔中。
使用例如（ThermoMixer）在室温下以800rpm摇动板30分钟。
使用高保真聚合酶例如，Phusion DNA聚合酶或BioMix Red建立20μlPCR反应，如制造商所建议的。使用1μl裂解细胞作为DNA模板。
注意：在多路复用的情况下，需要对每个目标位点进行单独的PCR。如果您有许多菌落和/或位点需要测试，我们建议您使用Plate Seq Kit PCR等试剂盒。在这种情况下，在该步骤中直接在试剂盒中提供的96孔PCR板中进行PCR反应。
按照聚合酶制造商的说明，在Thermocycler中扩增PCR产物。
在用Eurofins的Plate Seq试剂盒中用例如，Wizard SV凝胶和PCR净化系统或例如清除之后对PCR片段进行测序。

CRISPR-Cas9质粒缺失

如果您之前没有筛选质粒的丢失（参见步骤6之后的注释），用主板上的牙签挑选一些细胞，并在含有羧基的PD平板上划线。在28°C孵育两天。回到主板并使用不能在carboxin板上生长的菌落，这些菌落丢失了质粒。
注意：我们观察到质粒在主板上的菌落中保留了约5％的病例。
在carboxin平板上的生长意味着一些细胞仍然含有质粒。如果是这种情况，并且该菌落含有所需的突变，则在3ml不含羧基的YESPSL培养基中接种来自该菌株的细胞，并在28°C下生长过夜。
从这种过夜培养物中取出细胞并铺在不含羧基的PD平板上以获得单菌落。在28°C孵育两天。
两者上的复制板单菌落，具有羧基的PD板和不含羧基的PD板，并在28℃下孵育过夜。选择丢失质粒的菌落即，无法在含有羧基的平板上生长。
如有必要，重复质粒程序的丢失，直到选择平板上没有生长。

注意：重新排序最终克隆以验证您是否已获得所需的突变。

数据分析

应使用CloneManager或CLC Main Workbench等软件通过与野生型序列比对来分析测序数据。当缺失或插入的核苷酸数量不能除以3时，产生移码突变。或者，可以使用产生过早终止密码子的插入缺失。必须仔细检查测序色谱图并检查是否存在重叠峰。重叠峰是序列样品中遗传异质性的标志（图3）。

图3.代表性测序结果。野生型（WT）等位基因的核苷酸序列和色谱图的比对，缺失19bp的相应编辑等位基因和来自相同实验的异源样品。注意，测序公司为异源样品提供了一个序列（深橙色），考虑到最高峰并错误地提示序列同质性。只有通过仔细分析色谱图才能识别异质性，在这种情况下，色谱图显示直至箭头的序列（预测的Cas9切割位点）是均一的，并且从这一点开始变得异质。靶序列和PAM序列在野生型序列中描绘为彩色框。使用CLC Main Workbench生成对齐。

笔记

U中的CRISPR-Cas9系统。已证明maydis 对单基因的破坏是高效的，其中高达100％的测试转化体含有编辑的细胞（Schuster 等人，，2016）。对于编辑效率较低的sgRNA，使用更强的启动子（ ie ，P hsp70 而不是P otef <更高表达Cas9蛋白可以提高效率）通过在选择Cas9表达质粒的条件下将转化的细胞保持在液体培养物中来延长对Cas9的暴露（Schuster 等，，2018）。使用更长的Cas9曝光时间，我们已经能够使用多种sgRNA改进编辑。我们很少遇到目标序列，它们根本不起作用或者基因编辑效率很低。在这种情况下，改变目标序列提供了有效的解决方案。
已经分析了两个独立编辑的菌株的脱靶突变，并且没有通过全基因组测序发现的脱靶（Schuster et al。，2016）。由于脱靶对每个sgRNA都是特异性的，我们建议在给定基因或基因组中产生三个独立的突变体。如果这些突变体都表现出相同的表型改变，并且这种表型可以通过引入野生型基因来补充，那么您就有令人信服的证据表明该表型是由产生的突变引起的。
在设计多路复用实验时，应考虑待编辑基因的基因组位置。同一染色体中的两个或更多个同时的CRISPR事件可能导致不希望的染色体缺失或重排。在这种情况下，应该执行顺序编辑。

食谱

酵母提取物胰蛋白胨（dYT）培养基
该媒介包括：
1.6％（w / v）胰蛋白胨（BD Biosciences）
1％（w / v）酵母提取物（BD Biosciences）
双蒸水中0.5％（w / v）NaCl
注意：高压灭菌并在使用前储存在室温下。
酵母提取物胰蛋白胨（YT）琼脂培养基
该媒介包括：
0.8％（w / v）胰蛋白胨（BD Biosciences）
0.5％（w / v）酵母提取物（BD Biosciences）
0.5％（w / v）NaCl
双蒸水中1.3％Bacto琼脂（BD Biosciences）
注意：高压灭菌并立即倒入培养皿（每个培养皿20毫升）。
YEPSL液体培养基
该媒介包括：
0.4％（w / v）酵母提取物（BD Biosciences）
0.4％（w / v）蛋白胨（BD Biosciences）
双蒸水中2％（w / v）蔗糖（BD Biosciences）
注意：高压灭菌并在使用前储存在室温下。
再生琼脂灯（RegAgar）
该媒介包括：
1％（w / v）酵母提取物（BD Biosciences）
0.4％（w / v）蛋白胨（BD Biosciences）
0.4％（w / v）蔗糖（罗斯）
18.22％（w / v）山梨糖醇（Sigma）
双蒸水中1.5％Bacto琼脂（BD Biosciences）
注意：
1. 高压灭菌并在使用前储存在室温下。
2. 在U. maydis转化期间，将琼脂在微波炉中熔化，充分混合并冷却至50-60℃。加入Carboxin（4μg/ ml终浓度），将10ml该补充的RegAgar倒入培养皿中。一旦固化，将另外10ml不含羧基的熔融RegAgar作为顶层倒入相同的培养皿中。在铺设转化混合物之前，应将该第二层倒入约25-30分钟（参见Bösch等人，2016年的转化方案）。＆nbsp;
马铃薯葡萄糖（PD）琼脂培养基
该媒介包括：
2.4％马铃薯葡萄糖肉汤（BD Biosciences）
2％Bacto琼脂（BD Biosciences）在双蒸水中
注意：高压灭菌并立即倒入培养皿（每个培养皿20毫升）。

致谢

这项工作由马克斯普朗克协会资助。该协议改编自Schuster 等人（2016年和2018年）。我们要感谢Kahmann实验室的现任和前任成员，他们定期使用CRISPR-Cas9介导的基因组编辑，并提供有关该方案的反馈。作者声明，没有与本文相关的利益冲突或竞争利益。

参考

Bakkeren，G.，Kamper，J。和Schirawski，J。（2008）。黑穗病真菌的性别：交配型复合物的结构，功能和进化。真菌Genet Biol 45 Suppl 1：S15-21。
Barrangou，R.，Fremaux，C.，Deveau，H.，Richards，M.，Boyaval，P.，Moineau，S.，Romero，D.A。和Horvath，P。（2007）。 CRISPR在原核生物中提供对病毒的获得性抵抗。 Science 315（5819）：1709-1712。
Bösch，K.，Frantzeskakis，L.，Vraneš，M.，Kämper，J.，Schipper，K。和Göhre，V。（2016）。遗传操纵植物病原体 Ustilago maydis 研究真菌生物学和植物微生物相互作用。 J Vis Exp＆nbsp; （115）：e54522。
Deng，H.，Gao，R.，Liao，X。和Cai，Y。（2017）。丝状真菌中的CRISPR系统：当前成就和未来方向。基因 627：212-221。
Fu，Y.，Sander，J.D.，Reyon，D.，Cascio，V。M.和Joung，J。K.（2014）。使用截短的指导RNA提高CRISPR-Cas核酸酶特异性。 Nat Biotechnol 32（3）：279-284。
Gibson，D.G.，Smith，H.O.，Hutchison，C.A。，3rd，Venter，J。C. and Merryman，C。（2010）。小鼠线粒体基因组的化学合成。 Nat Methods 7（11）：901-903。
Heigwer，F.，Kerr，G。和Boutros，M。（2014）。 E-CRISP：快速CRISPR目标网站识别。 Nat Methods 11（2）：122-123。
Holliday，R。（2004）。关于 Ustilago maydis 重组和DNA修复的早期研究。 DNA修复（Amst）3（6）：671-682。
Holloman，W.K.，Schirawski，J。和Holliday，R。（2008）。 Ustilago maydis的同源重组系统。 Fungal Genet Biol 45 Suppl 1：S31-39。
Hsu，PD，Scott，DA，Weinstein，JA，Ran，FA，Konermann，S.，Agarwala，V.，Li，Y.，Fine，EJ，Wu，X.，Shalem，O.，Cradick，TJ，Marraffini ，LA，Bao，G。和Zhang，F。（2013）。 RNA靶向特异性RNA引导的Cas9核酸酶。 Nat Biotechnol 31（9）：827-832。
Jinek，M.，Chylinski，K.，Fonfara，I.，Hauer，M.，Doudna，J。A.和Charpentier，E。（2012）。自适应细菌免疫中可编程的双RNA指导DNA核酸内切酶。科学 337（6096）：816-821。
Kämper，J.，Kahmann，R.，Bolker，M.，Ma，LJ，Brefort，T.，Saville，BJ，Banuett，F.，Kronstad，JW，Gold，SE，Muller，O.，Perlin，MH， Wosten，HA，de Vries，R.，Ruiz-Herrera，J.，Reynaga-Pena，CG，Snetselaar，K.，McCann，M.，Perez-Martin，J.，Feldbrugge，M.，Basse，CW，Steinberg ，G.，Ibeas，JI，Holloman，W.，Guzman，P.，Farman，M.，Stajich，JE，Sentandreu，R.，Gonzalez-Prieto，JM，Kennell，JC，Molina，L.，Schirawski，J 。，Mendoza-Mendoza，A.，Greilinger，D.，Munch，K.，Rossel，N.，Scherer，M.，Vranes，M.，Ladendorf，O.，Vincon，V.，Fuchs，U.，Sandrock ，B.，Meng，S.，Ho，EC，Cahill，MJ，Boyce，KJ，Klose，J.，Klosterman，SJ，Deelstra，HJ，Ortiz-Castellanos，L.，Li，W.，Sanchez-Alonso， P.，Schreier，PH，Hauser-Hahn，I.，Vaupel，M.，Koopmann，E.，Friedrich，G.，Voss，H.，Schluter，T.，Margolis，J.，Platt，D.，Swimmer ，C.，Gnirke，A.，Chen，F.，Vysotskaia，V.，Mannhaupt，G.，Guldener，U.，Munsterkotter，M.，Haase，D.，Oesterheld，M.，Mewes， HW，Mauceli，EW，DeCaprio，D.，Wade，CM，Butler，J.，Young，S.，Jaffe，DB，Calvo，S.，Nusbaum，C.，Galagan，J。and Birren，BW（2006）。生物营养真菌植物病原体基因组的见解 Ustilago maydis 。自然 444（7115）：97-101。
Lanver，D.，Muller，AN，Happel，P.，Schweizer，G.，Haas，FB，Franitza，M.，Pellegrin，C.，Reissmann，S.，Altmuller，J.，Rensing，SA和Kahmann，R （2018年）。通过RNA-Seq分析研究 Ustilago maydis 的生物营养发育。植物细胞 30（2）：300-323。
Lanver，D.，Tollot，M.，Schweizer，G.，Lo Presti，L.，Reissmann，S.，Ma，LS，Schuster，M.，Tanaka，S.，Liang，L.，Ludwig，N。和Kahmann，R。（2017）。 Ustilago maydis 效应器及其对毒力的影响。 Nat Rev Microbiol 15（7）：409-421。
Niessing，D.，Jansen，R。P.，Pohlmann，T。和Feldbrugge，M。（2018）。真菌顶级模型中的mRNA转运。 Wiley Interdiscip Rev RNA 9（1）。
Schulz，B.，Banuett，F.，Dahl，M.，Schlesinger，R.，Schafer，W.，Martin，T.，Herskowitz，I。和Kahmann，R。（1990）。 U的b等位基因。 maydis ，其组合程序致病性发展，含有同源域相关基序的多肽编码。 Cell 60（2）：295-306。
Schuster，M.，Schweizer，G。和Kahmann，R。（2018）。植物致病性黑穗病真菌和相关担子菌中分泌蛋白的比较分析。真菌Genet Biol 112：21-30。
Schuster，M.，Schweizer，G.，Reissmann，S。和Kahmann，R。（2016）。 Usti中的基因组编辑 lago maydis 使用CRISPR-Cas系统。 Fungal Genet Biol 89：3-9。
Shi，T.Q.，Liu，G.N.，Ji，R.Y.，Shi，K.，Song，P.，Ren，L.J.，Huang，H。和Ji，X.J。（2017）。基于CRISPR / Cas9的丝状真菌基因组编辑：最先进的技术。 Appl Microbiol Biotechnol 101（20）：7435-7443。
Steinberg，G。（2007）。交通路径：植物病原体中的微管 Ustilago maydis 。 New Phytol 174（4）：721-733。
Tsukuda，T.，Carleton，S.，Fotheringham，S。和Holloman，W。K.（1988）。从 Ustilago maydis 中分离和鉴定自主复制序列。 Mol Cell Biol 8（9）：3703-3709。