材料和试剂

无核酸酶微量离心管
无核酸酶微量吸头提示
丁腈粉手套
液氮
RNase（ribonuclease）Away（赛默飞世尔科技，目录号：7000TS1）
Trizol（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：15596026）
24：1氯仿：异戊醇（Acros Organics，目录号：327155000）＆nbsp;
75％和100％乙醇
无核酸酶水（未经DEPC处理）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：4387936）
Turbo DNase（脱氧核糖核酸酶）（Thermo Fisher Scientific，Ambion TM ，目录号：AM2238）
RNA Clean and Concentrator kit（ZYMO RESEARCH，目录号：R1015）
冷冻异丙醇

设备

移液器（BioExpress，GeneMate，目录号：P-3960-20）
砂浆和杵（Harold Import，HIC，目录号：43717）
Vortexer（BioExpress，GeneMate，目录号：S-3200-1）
冷冻微量离心机（Labnet International，目录号：C2500-R）
水浴
-80°C冰柜
通风柜（KEWAUNEE，型号：H05_5460-00）
Nanodrop分光光度计（Thermo Fisher Scientific，USA）

程序

RNA提取
注意：它是从标准的Trizol TM 程序修改的。
1. 使用RNase（核糖核酸酶）AWAY喷涂手套，设备和所有材料。
2. 通过将叶子在液氮中浸泡5秒来快速冷冻约100mg叶子。
  提示：快速冷冻比直接用液氮压碎叶子更好。
3. 使用研钵和研杵（不需要冷却）在1ml Trizol存在下研磨冷冻叶子，然后用移液管转移到无核酸酶的微量离心管中。
  注意：此步骤应在通风橱内进行。
4. 在室温（RT）下孵育管5分钟。
5. 然后在管中加入200μl24：1氯仿：异戊醇，涡旋混匀。
  提示：样品必须涡旋直至其均匀绿色。这种涡旋步骤对RNA的高产量至关重要。
6. 在室温下孵育该混合物2分钟。
7. 然后在4,000℃下以12,000 x g 离心15分钟。
8. 将上清液（含有RNA的水相）转移到新管中。
  提示：注意转移的相量。
9. 将冷却的异丙醇加入新管中，体积为原始体积水相的0.5倍。
  提示：异丙醇必须冷却，否则RNA的产量可能会低。
10. 将混合物剧烈涡旋至少10秒并在-20℃下孵育约15分钟。
11. 将混合物在12,000 x g 4℃下离心10分钟。
12. RNA可以看作是管底部的一个小白色颗粒。
13. 加入500μl75-80％乙醇洗涤RNA沉淀，并在7,000 xg 旋转5分钟后丢弃上清液（潜在停止点可以存储在 - 20°C，最长一周）。
14. 再次旋转试管（不添加任何试剂），然后除去粘在微量离心管壁上的残留乙醇。
15. 将倒置管放入通风橱内，将颗粒风干15分钟。
16. 然后将沉淀重悬于40μl不含核酸酶的水中，并在水浴中孵育，将管在60℃下打开15分钟以使其完全溶解。微量离心管的盖子应保持开放，以便有效蒸发残留的乙醇（潜在停止点：样品可以储存在-80°C）。储存在-80°C的样品必须在冰上解冻并按以下步骤处理。
RNA纯化
注意：它是从ZYMO Clean and Concentrator Kit TM 协议（ZYMO RESEARCH，USA）修改的。
1. 向RNA中加入80μlRNA结合缓冲液（见上文）并用移液管尖轻轻混合。
2. 然后向管中加入120μl100％乙醇，然后温和混合。
3. 将RNA样品转移到收集管中的Zymospin柱上，在4℃下以12,000 x g 旋转30秒。
4. 通过在4,000℃下以12,000 x g 旋转30秒，用400μlRNA洗涤缓冲液洗涤柱子。流程将被丢弃。
5. 通过在微量离心管中轻轻混合5μlTurboDNA酶（Thermo Fisher Scientific，Ambion TM ）和35μlDNA消化缓冲液（ZYMO RESEARCH，USA）来制备DNase混合物。
6. 将鸡尾酒加入RNA柱中，在室温下孵育20分钟。
  提示：更长的孵育时间不会提高纯度。
7. 向柱中加入约400μlRNAPrep缓冲液，并在4℃下以12,000 x g 旋转30秒。然后丢弃流量。
8. 使用400μlRNA洗涤缓冲液（如步骤B4）再次洗涤柱两次。
9. 旋转色谱柱（不添加任何试剂）2分钟以除去残留的乙醇。
10. 最后，将色谱柱转移到新的无核酸酶微量离心管中。
11. 向柱中加入约20μl不含核酸酶的水，并在室温下孵育2分钟。在4℃下以12,000 x g 旋转2分钟后收集流量。
12. 移出流出物并再次将其添加到色谱柱中。
13. 在室温下孵育柱2分钟，并在4℃下以12,000 x g 旋转2分钟后收集纯RNA。

数据分析

RNA测量：使用Nanodrop分光光度计测量提取的RNA的浓度。使用四个生物学重复。分光光度图像（图1）显示我们提取的RNA从240 ng开始具有高产量。纯RNA被认为具有A 260 ：A 280 比率在1.8和2.2之间（Ouyang et al。，2014）。由于我们的RNA具有2.06-2.11的比率，因此显示该提取方案产生纯RNA。在260nm处的单个清晰峰显示RNA提取没有任何污染物。

图1.从 P中提取的RNA的Nanodrop分光光度计图像。使用改进的方法进行细长 260/280比率为2.09（A），2.07（B），2.06（C）和2.11（D）。四张图片代表四种不同的生物样本。

RNA完整性：通过运行RNA凝胶评估RNA完整性。将不经我们的纯化程序提取的RNA样品与按照我们修改的方案提取的RNA样品进行比较。将约5μl的每种RNA样品加载到每个孔上。 RNA凝胶显示使用我们的方案获得的样品的清晰，不同的18S和28S核糖体RNA条带（图2）。用其他方法获得的RNA样本有涂片，表明存在基因组DNA污染。

图2. RNA凝胶图片。 A1，A2，A3： P.没有我们的纯化程序的细长RNA。 B1，B2，B3，B4： P.使用改良方法1-4提取的细菌RNA表明不同的生物控制（图片的颜色已经改变为灰度）。

RNA下游应用为了测试提取的RNA的效率，将样品用于RT-PCR和qPCR作为模板。使用来自从提取的RNA逆转录的cDNA的遍在蛋白引物成功扩增PCR产物。使用的PCR条件是 - 在95℃下初始变性5分钟，30个PCR循环，在95℃变性30秒，在50℃退火30秒，在72℃延伸45秒，最后在72°C下延伸7分钟。四个生物学重复用于RT-PCR。在约250bp处观察到清晰的遍在蛋白条带（图3）。使用qPCR测试mRNA（信使RNA）的完整性。 qPCR条件为：在95℃下初始变性30秒，39个循环，在95℃变性5秒，在50℃退火30秒，然后进行熔解曲线分析。将4个生物学重复和3个技术重复用于qPCR。
从qPCR获得的扩增曲线（图4）显示mRNA在总RNA样品中未降解，并且遍在蛋白基因存在于所有4种生物样品中。熔解曲线图显示泛素引物具有高度特异性，结果不是由于假阳性（图4）。这些结果表明，我们提取的RNA质量适合PCR和qPCR等基础实验。

图3.使用通过该方法提取的RNA的遍在蛋白基因的RT-PCR凝胶（在3-6的所有四个泳道中观察到250bp大小的遍在蛋白条带）。泳道1：梯形;泳道2：阴性对照（水）;车道3-6： P.使用从4种不同生物对照中提取的RNA，通过遍在蛋白引物扩增细胞cDNA。

图4.在来自 P的遍在蛋白基因的qPCR中观察到的扩增曲线（顶部）和解链曲线（底部）。细菌 cDNA
结论
在我们的研究中，我们开发了一种方案，用于从顽拗型树种 P的叶子中有效分离高质量的RNA。泡桐。由于 P叶中存在大量生物碱和蛋白质，使用CTAB或旋转柱的传统方法无法以高产率生成这种质量的RNA（数据未显示）。泡桐。我们开发的方法是快速（2小时），通用和高产。我们相信这种方法可用于从各种顽拗型植物中分离RNA。

致谢

作者声明没有利益冲突。作者希望感谢以下两个奖项/奖学金颁发给加州州立大学北岭分校的NR：论文/项目/论文/支持奖和Richard Duenckel Gardens俱乐部奖学金。该协议已用于我们最近发表的研究论文（Ramadoss等，2018）。

参考

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Ramadoss，N.，Gupta，D.，Vaidya，B.N.，Joshee，N。和Basu，C。（2018）。拟南芥中1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因的功能特征及其提供的潜力洪水容忍。 Biochem Biophys Res Commun 。 doi：10.1016 / j.bbrc.2018.06.036。
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