材料和试剂

移液器吸头
15毫升和50毫升CELLSTAR ®聚丙烯管（锥形）（Greiner Bio One International，CELLSTAR ®，产品目录号分别为：188271和227261）
塑料培养皿94 x 16带通风口轻型（Greiner Bio One International，目录号：633181）
12 ml细胞培养管（Greiner Bio One International，CELLSTAR ®，目录号：163160）
接种循环
Eppendorf管®安全锁管1.5 ml（Eppendorf，目录号：0030120086）
电穿孔比色皿，2 mm间隙（Bio-Rad Laboratories，目录号：1652086）
半微量比色皿，1毫升（用于光密度测量）
细菌菌株： L.具有一整套能力基因的感兴趣的乳酸菌 L.含有pNZ6200（Mulder et al。，2017），pNZ6202（Mulder 等人，2017）和pNZ9531（Kleerebezem 等。，1997a）
M17肉汤（M17）和M17琼脂（M17A）（氚，目录号分别为：M086.76.0200和M085.76.0200）
葡萄糖溶液（20％，氚，目录号：G209.65.0080）
蒸馏水（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：15230089）
抗生素储备液：
20 mg / ml氯霉素（Sigma-Aldrich，目录号：C0378-100G）
20mg / ml红霉素（Fisher Scientific，目录号：BP920-25）
12.5 mg / ml盐酸四环素（Sigma-Aldrich，目录号：T7660-25G）
NisinA ® P超纯Nisin A（Handary，布鲁塞尔，比利时，在含有0.05冰醋酸的蒸馏水中制备2 mg / ml储备液）
或者：来自乳酸乳球菌 2.5％的乳链菌肽（Sigma-Aldrich，目录号：N5764）
JETSTAR 2.0 Maxiprep试剂盒（GENPRICE，目录号：220 020）或PureLink TM HiPure Plasmid Maxiprep试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：K210007）
Qubit TM dsDNA BR检测试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：Q32850）
Phenol BioUltra，用于分子生物学，TE饱和，~73％（T）（Sigma-Aldrich，目录号：77607）
氯仿HPLC级，≥99.9％（Sigma-Aldrich，目录号：528730）
溴化乙锭（Sigma-Aldrich，目录号：E1510-10ML）
琼脂糖片（美国生物技术资源，目录号：G01PD-500）
冰醋酸（Scharlab，目录号：AC03522500）
β-甘油磷酸盐（二钠盐）（Sigma-Aldrich，目录号：50020-500G）
磷酸氢二钾（K 2 HPO 4 ）（默克，目录号：1.05104.1000）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）（默克，目录号：1.04873.1000）
醋酸钠（默克，目录号：1.06268.1000）
（NH 4 ） 3 - 柠檬酸（Sigma-Aldrich，目录号：A1332-500G）
抗坏血酸（VWR，AnalaR NORMPAPUR ®，目录号：20150.231）
氯化锰（II）四水合物（MnCl 2 ·4H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M8054-100G）
腺嘌呤（Sigma-Aldrich，Fluka，目录号：01830）
鸟嘌呤（Sigma-Aldrich，目录号：G11950-100G）
Uracil（Sigma-Aldrich，Fluka，目录号：94220）
黄嘌呤（Sigma-Aldrich，目录号：X7375-10G）
丙氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：A7627-100G）
精氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：A5006-500G）
天冬氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：A9256-100G）
半胱氨酸-HCl（Sigma-Aldrich，目录号：C1276-250G）
谷氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：G1251-500G）
甘氨酸（默克，目录号：1.04201.0250）
组氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：H8000-100G）
亮氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：L8000-100G）
赖氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：L5626-100G）
蛋氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：M9625-100G）
苯丙氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：P2126-100G）
脯氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：P0380-100G）
丝氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：S4500-100G）
苏氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：T8625-100G）
色氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：T0254-100G）
缬氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：V0500-100G）
氯化镁六水合物（MgCl 2 ·6H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M2670-100G）
氯化钙二水合物（CaCl 2 ·2H 2 O）（默克，目录号：1.02382.0500）
硫酸锌七水合物（ZnSO 4 ·7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：Z0251-100G）
硫酸钴（II）七水合物（CoSO 4 ·7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C6768-100G）
硫酸铜（II）五水合物（CuSO 4 ·5H 2 O）（Scharlab，目录号：CO01010500）
钼酸铵四水合物（（NH 4 ） 6 Mo 7 O 24 ·4H 2 O）（Sigma-Aldrich，Fluka，目录号：09878）
氯化铁（II）四水合物（FeCl 2 ·4H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：44939-50G）
盐酸（HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：30721-1L）
氯化铁（III）六水合物（FeCl 3 ·6H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：F2877-100G）
对氨基苯甲酸（Sigma-Aldrich，目录号：A9879-100G）
肌苷（Sigma-Aldrich，目录号：I4125-25G）
乳清酸（Sigma-Aldrich，目录号：O2750-100G）
吡哆胺-HCl（Sigma-Aldrich，目录号：P9380-5G）
胸苷（Sigma-Aldrich，目录号：T9250-10G）
D-生物素（Sigma-Aldrich，目录号：B4501-5G）
6,8-硫辛酸（Sigma-Aldrich，目录号：T5625-5G）
吡哆醇-HCl（Sigma-Aldrich，目录号：P9755-25G）
叶酸（Sigma-Aldrich，目录号：F7876-25G）
烟酸（Sigma-Aldrich，目录号：N4126-5G）
Ca-（D +）泛酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：P5155-100G）
核黄素（Sigma-Aldrich，目录号：R4500-25G）
硫胺-HCl（Sigma-Aldrich，目录号：T4625-100G）
维生素B12（Sigma-Aldrich，目录号：V2876-5G）
或者，PCR产物（用KOD热启动DNA聚合酶获得）
注意：含有抗生素抗性标记，其侧翼为染色体片段，通过重叠PCR获得整合（Horton等，1990），如果优于质粒转化，例如，用于构建基因置换突变体。 < br />
可选：KOD热启动DNA聚合酶Master Mix（Merck，Novagen，目录号：71842-4）
GSGM17（见食谱）
洗涤液1（见食谱）
洗涤液2（见食谱）
回收介质（见食谱）
CDM（见食谱）
GCDM（化学成分确定的培养基补充葡萄糖）
清洁发展机制的储备解决方案（见食谱）
1. 核苷酸溶液
2. MnCl 2 ·4H 2 O溶液
3. 氨基酸溶液
4. 金属解决方案
5. 铁解决方案
6. 维生素溶液

设备

普通移液器
200毫升的瓶子
水浴（30°C和55°C）
孵化炉在30°C
涡旋
高压灭菌器
微量离心机（Eppendorf ®冷冻微量离心机）（Eppendorf，型号：5417R）
离心15和50毫升管（Heraeus Megafuge 1.0R）
Qubit ® 2.0荧光计（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，模式：Qubit ® 2.0）
Electroporator（Bio-Rad Laboratories，型号：GenePulserXcell TM ）
分光光度计（Genesys 10紫外分光光度计）
Nanodrop ND1000分光光度计（NanoDrop Technologies）（Thermo Fisher Scientific，型号：NanoDrop TM 1000

程序

质粒DNA分离
1. 文化 L.乳酸含有pNZ6200，pNZ6202或pNZ9531，在含有适当抗生素（表1）的200毫升瓶中，在含有适当抗生素（表1）的200毫升M17中加入1％葡萄糖，不振摇过夜。
  
  表1.本协议中使用的质粒特征
2. 通过在室温下以5,000 x g 离心15分钟沉淀细胞。
3. 弃去培养上清液，将颗粒在-20°C冷冻至少30分钟。
4. 将沉淀重悬于含有40mg溶菌酶的10ml重悬浮缓冲液（来自Maxiprep试剂盒的制造商溶液）中。
5. 在55°C孵育1.5小时，不要摇晃。
6. 根据制造商的方案，从JETSTAR 2.0 Maxiprep Kit或PureLink TM HiPure Plasmid Maxiprep Kit继续进行质粒分离。
7. 在制造商的方案中加入一些额外步骤：将裂解液离心沉淀至细胞碎片后，对上清液进行苯酚 - 氯仿提取（苯酚：氯仿：上清液，体积比为1：1：1，混合物）通过倒置管）并在5,000 xg 下离心30分钟。将水相（上层）转移到新管中，并进行氯仿抽提（水相：氯仿1：1体积），随后在5,000 x g 下离心15分钟。从制造商的试剂盒中加载纯化的级分，以便结合DNA并继续执行手册中指示的步骤。
8. 通过Qubit确定质粒DNA的DNA浓度（每次转化需要1μgDNA，其中质粒溶液的浓度基于Qubit测量）。
9. 在1％琼脂糖凝胶上检查分离的质粒DNA的质量。
pNZ6200和pNZ9531电转化为电感受态 L.乳酸细胞（图1）。
1. 准备1L电子能力生长培养基GSGM17,500ml洗涤溶液1和500ml洗涤溶液2（参见配方）。
2. 文化 L.乳酸最初在10 ml GM17中在12 ml细胞培养管中过夜，在30°C下无需摇动即可孵育。
3. 第二天，将5 ml培养物接种到50 ml GSGM17中，在30°C温育细胞过夜，不要摇晃。
4. 如果过夜培养物达到OD 600 ≥0.7，则在GSGM17中以1：8稀释过夜培养物，并使培养物生长至OD 600 0.2-0.3。 >
5. 通过在4℃下以6,000 x g 离心20分钟沉淀细胞。
6. 用1体积冰冷的洗涤溶液洗涤沉淀1.
7. 通过在4℃下以5,000 x g 离心20分钟来沉淀细胞。
8. 用0.5体积冰冷的洗涤溶液2洗涤沉淀，并在冰上孵育15分钟。
9. 通过在4℃下以5,000 x g 离心20分钟来沉淀细胞。
10. 用0.25体积的冰冷洗涤溶液1洗涤沉淀，并通过在4℃下以5,000 x g 离心20分钟沉淀细胞。
11. 将细胞重悬于0.01体积的冰冷洗涤溶液1中，每50μl等分细胞。
12. 立即使用新鲜的电感受态细胞进行转化，获得所需的质粒。
  选项：存储细胞以供以后在-80°C下使用。
13. 将电子比色皿置于冰上，制备含有补充有1％葡萄糖，200 mM MgCl 2 和20 mM CaCl 2 的M17的回收培养基，并将其保存在冰上。 br />
14. 将1μg质粒加入到电感受态细胞中，并将带有DNA的细胞悬液转移到电子比色杯中。
  注意：在向电感受态细胞中加入质粒DNA后，不要上下移液。轻轻地轻弹管子，混合细胞和质粒DNA。
15. 电穿孔;电穿孔装置的设置：电压= 2,000 V，容量=25μF，电阻=200Ω。
  1. 用纸巾擦干电子比色杯，轻轻地将电子比色杯轻轻敲打到工作台上5次，将细胞滑落到电子比色杯的底部。
  2. 将电子比色杯放入电穿孔仪的比色皿支架中并施加电脉冲。
16. 尽快将1毫升冰冷的回收培养基加入电子比色杯中，然后将电子比色杯再次放在冰上。
17. 将电池中的细胞吸移到1.5 ml Eppendorf管中，在30°C水浴中孵育样品1小时，不要摇晃。
18. 在含有适当抗生素的选择平板上的回收培养基中移取10 0 至10 -6 的系列稀释液。
19. 在30°C非振荡条件下孵育平板2-3天。
20. 在GM17琼脂平板上清洁条纹阳性菌落，补充适当的抗生素。
  注意：如果pNZ9531和pNZ6200的共转化不成功，首先用pNZ9531转化细胞。在GM17中选择阳性菌落和培养菌落，补充有10μg/ ml红霉素。随后，重复电泳能力细胞的制备，并通过电穿孔引入pNZ6200。
21. 第二天，从GM17清洁条纹平板培养单菌落，补充适当的抗生素，在30°C，非摇动条件下孵育过夜。
22. 准备25％甘油原液并储存在-80°C。
L中自然能力的诱导。球菌
1. 准备GCDM（参见食谱）并用适当的抗生素制备GM17琼脂平板。
2. 文化 L.乳酸分别在含有适当抗生素的10 ml GCDM中含有pNZ6200和pNZ9531（表1）。
3. 准备一个含有50毫升GCDM的50毫升CELLSTAR ®聚丙烯管。
4. 将细胞和含有50 ml GCDM的50 ml CELLSTAR ®聚丙烯管在30°C温育培养炉中过夜孵育过夜。
5. 第二天，将氯霉素和红霉素加入含50 ml GCDM的50 ml CELLSTAR ®聚丙烯管中。
6. 通过在OD 600 下测量光密度，在半微量比色杯（=空白样品）中加入1 ml GCDM。
7. 加入750μl L.乳酸将pNZ6200过夜培养物置于含有GCDM的50 ml CELLSTAR ®聚丙烯管中。
8. 通过倒置封闭的管混合细胞培养物。
9. 将1ml培养物吸移到半微量比色皿中并在30℃水浴中不振摇培养细胞直至培养物达到OD <600> 0.3（约3-4小时后）。
10. 测量培养物的初始OD 600 。
  注意：t = 0时文化的OD 600 应该在0.03左右。如果OD 600 低于0.03;增加更多文化。
11. 在非摇动条件下培养细胞直至OD 600 为0.3（对应于约2-3×10 8 细胞）。
12. 准备计算和恢复培养基（参见食谱，每次转化5毫升回收培养基）。
13. 将OD 600 0.3的10ml细胞培养物转移到12ml无菌管中。
14. 重复此步骤以获得总共3个等分培养物。
  注意：这些培养物将用于后续步骤，包括用0 ng / ml（阴性对照），0.03 ng / ml（最佳）和2 ng / ml（完全诱导）乳链菌肽诱导comX表达。
15. 随后，使用NisinA ® P超纯乳链菌肽A或来自乳酸乳球菌 2.5的乳链菌肽制备乳链菌肽稀释液％（Sigma-Aldrich，2.5％乳链菌肽）。
16. 使用含有0.05％冰醋酸的蒸馏水在玻璃管中制备乳链菌肽稀释液，以提高乳链菌肽溶液的稳定性。
  注意：当使用2.5％乳酸乳球菌（Sigma-Aldrich）的乳链菌肽时，请确保校正稀释因子（40x），因为只有2.5％的干物质是乳链菌肽。
17. 用乳链菌肽诱导10ml培养物。为获得最佳转化率，用乳链菌肽诱导细胞至终浓度为0.03 ng / ml乳链菌肽。
  注意：
  1. 可选：作为对照，包括未诱导的样品和完全诱导的样品（2 ng / ml）。
  2. 升。含有2 ng / ml乳链菌肽诱导的pNZ6200的乳酸菌KF147将在诱导1 h后停止生长，但其他菌株可能在此浓度下继续生长。
18. 加入乳链菌肽后，立即将管倒置3次。
19. 将600μl诱导培养物放入Eppendorf管中。
20. 加入1μgpNZ6202。
  注意：其他兼容的质粒很可能也可用于评估转化效率。
21. 通过倒置管进行混合。
22. 在30°C下在水浴中孵育2小时，不要摇晃。
  注意：与乳链菌肽进行更长时间的孵育不会导致转化率增加（见图2）。
  
  图2.在 L中延长乳链菌肽诱导后的转化率（转化体/诱导后的总细胞数/μg质粒DNA）。含有pNZ6200的乳酸菌KF147 在未诱导的（实心圆圈），中度诱导的（实心方块）和完全诱导的（实心三角形）培养物中检查转化。未诱导和完全诱导 L.含有pNZ6200的乳酸 KF147在缩短，标准（2小时）和用乳链菌肽延长诱导后不能转化。中度诱导 L.含有pNZ6200的乳酸菌KF147可在长时间的乳链菌肽诱导后转化，但与标准培养时间相比，延长诱导不会导致转化率增加。
23. 将100μl每种样品吸取到含有900μlGM17的半微量比色杯中，测量样品的OD 600 或进行总细胞计数。
  注意：取1毫升GM17作为新的空白。
24. 将剩余的500μl加入5 ml回收培养基中的15 ml试管中，在30°C水浴中再摇动2小时，不要摇晃。
  注意：转化含有抑菌抗生素抗性基因的质粒或PCR产物时，不需要进行此恢复步骤。
25. 在含有750μlGM17的半微量比色皿中加入250μl培养物，测量OD 600 或进行总细胞计数。
26. 将剩余的培养物在15 ml CELLSTAR ®聚丙烯管中沉淀，在4,000 x g 下离心10分钟。
27. 弃去上清液，将100μl培养基留在沉淀上，重悬浮并用适当的抗生素将所有细胞培养在GM17A（M17琼脂补充2％葡萄糖）上。
28. 将培养皿中的培养板保持在30°C下2至3天。
29. 将转化率计算为（转化子/诱导后的总细胞数/μg质粒DNA）。

数据分析

来自目标菌株的能力蛋白质与查询序列的序列相似性应该进行BlastP分析以通过将其能力蛋白质序列与来自 L的查询序列进行比较来评估目标菌株中能力系统的完整性。乳酸亚种 lactis KF147或 L.乳酸亚种 cremoris KW2（附录 1 ; 2 ; 3 ）。如前所述，主题序列与查询序列的几乎全长比对（> 90％）被认为是基因存在的指示（Mulder 等人，2017）。通常，10 -5 的e值表示显着的比对。如果需要，可以通过生物信息学软件（如克隆管理器套件）进一步分析导致能力基因衰退的遗传事件。
转换率的计算
每个实验中应包括至少三次重复，以计算乳链菌肽诱导的 L的平均转化率。乳酸菌菌株。如图1所示，通过使用Graphpad Prism或任何其他软件，可以在表格中或（在多个时间点的情况下）显示转换率。

笔记

L的电感受态细胞的制备。 lactis 基于Wells et al。，1993。
如果菌株在含甘氨酸的培养基中显示出不良生长（即，则过夜培养物未达到OD 600 0.7），该菌株需要通过以下方法适应GSGM17培养基：用常规GM17（补充有2％葡萄糖的M17）1：4稀释该培养基，然后在含有增加量甘氨酸的培养基中连续传代培养，最终达到GSGM17中的0.4M甘氨酸浓度。如果细胞不能适应GSGM17中0.4 M甘氨酸的存在，那么可能使用最高浓度的甘氨酸。
L.感兴趣的乳酸菌株应具有一套完整的能力基因，以便在 comX 过表达时诱导能力。 com 基因集的完整性可以通过使用任一亚种的参考序列的BlastP分析来评估。 lactis （附录1 ）或亚种。 cremoris 作为查询（附录2 ）。
pNZ9531的类似替代质粒pNZ9530也可能用于获得 nisRK + 菌株。事实上，当使用pNZ9530时，预计可以实现对 nisRK 表达的更严格控制（Kleerebezem et al。，1997a）。
用于从 L中提取pNZ9530或pNZ9531（分别为低和中拷贝质粒）。 lactis 菌株：将该菌株接种于25ml补充有10μg/ ml红霉素的GM17中，无需搅拌。第二天，准备4瓶200ml GM17，补充10μg/ ml红霉素，并将5ml过夜培养物转移到每个瓶中。将细胞培养至OD1 <600> 0.5-1，并通过在5,000×g离心15分钟沉淀细胞。从质粒DNA分离程序继续步骤3。
在 L中存在 nisRK 的染色体拷贝。可以检查感兴趣的lactis 菌株（使用附录3 用于BlastP分析的NisR和NisK查询序列）。如果感兴趣的菌株含有 nisRK ，那么pNZ9530 / pNZ9531不需要用这些质粒中的一种进行转化。
然而，如果菌株还含有也是乳链菌肽生产者的 nisRK ，这可能导致 comX 的组成型诱导，这可能不会导致能力诱导的有利条件。在这种情况下，替代方案可以是用pGIBLD001转化细胞（ P 32 对照下的 comX 的组成型表达[David et al。，2017]）。
如果由于某种原因GCDM不能用作 L的培养基。乳酸能力，可以使用M17，然而， L的转化率降低至少10倍。含有pNZ6200的乳酸 KF147（数据未显示）。如果需要在不含核黄素等荧光成分的培养基中进行能力诱导，我们建议使用CDMPC（化学成分确定培养基延长培养[Goel 等，2012]）尽管转化率降低（1×10 -7 转化体/诱导后的总细胞数/μg质粒DNA） L.乳酸 KF147在该培养基中含有pNZ6200。
L的能力归纳。 lactis 也可以在高通量设置中进行。然而，我们建议首先在12 ml细胞培养管中诱导培养物，收集600μl诱导培养物样品，每次加入1μgDNA和3次200μl种子到96孔板中。诱导3小时后，通过使用多通道移液管，5μl可用于在具有适当抗生素的GM17板上进行点镀。将离心培养物中的其余培养物在板式离心机中以3,700 x g 离心10分钟，弃去150μl上清液。将沉淀的细胞重新悬浮在剩余的培养基中，用含有适当抗生素的GM17平板上的5μl多通道移液管进行检测。对于 L.含有pNZ6200的乳酸菌KF147，我们能够获得相似的转化率（1.5×10 -6 ±4.0×10 -7 转化体/诱导后的总细胞数如先前所报道的（μg质粒DNA）（Mulder 等人，，2017）。具有侧翼为同源区域的抗生素抗性标记的线性DNA片段的整合也可以通过使用该方案进行。对于 L.乳酸 KF147含有pNZ6200的自然转化率通常与pNZ6202相似（Mulder et al。，2017）。

食谱

GSGM17（1 L）
M17中等
2％葡萄糖
0.5M蔗糖（= 170g）
0.4M甘氨酸（= 30g）
在121°C高压灭菌15分钟
洗涤液1（500毫升）
0.5M蔗糖（= 85g）
10％v / v甘油
RO（反渗透）水
在121°C高压灭菌15分钟
洗涤液2（500毫升）
0.5M蔗糖（= 85g）
0.05 M EDTA
10％v / v甘油
RO（反渗透）水
在121°C高压灭菌15分钟
恢复介质
GM17
注意：GM17与M17肉汤相同，但补充0.5％葡萄糖（w / v）
20mM MgCl 2
2 mM CaCl 2
化学定义培养基（CDM）（500 ml）
注意：乳酸乳球菌的CDM配方基于Otto等，1983; Poolman和Konings，1988年

用RO（反渗透）水加入500毫升
将pH调节至6.8
过滤500毫升无菌500毫升瓶消毒
GCDM（化学成分确定的培养基补充葡萄糖）
在培养乳酸乳球菌细胞之前，将灭菌的葡萄糖（20％溶液，氚）加至终浓度为2％至CDM，以获得GCDM
CDM的股票解决方案
注意：*需要在使用当天准备的解决方案
1. 核苷酸溶液*
  
  新鲜，然后使用5毫升
2. MnCl 2 ·4H 2 O溶液*
3. 氨基酸溶液
  
  在室温下溶解于6.5 pH（允许1小时）
  将其分装到50 ml CELLSTAR ®聚丙烯管中，并储存在-20°C
4. 金属解决方案
  
  分装到6毫升管中，储存在-20°C
5. 铁解决方案
  
  分装到6毫升管中，储存在-20°C
6. 维生素溶液
  
  增加pH值直至所有组分溶解。然后，将pH调节至7.0
  将其分装到6ml管中并在-20℃下储存

致谢

我们感谢NIZO的Sabri Cebeci和Koen Giesbers提供技术支持。这项工作是在BE-Basic R＆amp; D计划内进行的，该计划获得了荷兰经济部的FES补贴。该协议改编自Mulder et al。（2017）。作者没有任何利益冲突申报。

参考

Blokesch，M。（2016）。转型的自然能力。 Curr Biol 26（21 ）：R1126-R1130。
Blomqvist，T.，Steinmoen，H。和Havarstein，L。S.（2006）。自然遗传转化：一种用于乳酸菌嗜热链球菌的高效基因工程的新工具。 Appl Environ Microbiol 72（10）：6751-6756。
David，B.，Radziejwoski，A.，Toussaint，F.，Fontaine，L.，Henry de Frahan，M.，Patout，C.，van Dillen，S.，Boyaval，P.，Horvath，P.，Fremaux， C.和Hols，P。（2017）。天然DNA转化在 Lactococcus lactis ssp中有功能。 cremoris KW2。 Appl Environ Microbiol 。
Fontaine，L.，Dandoy，D.，Boutry，C.，Delplace，B.，de Frahan，M.H.，Fremaux，C.，Horvath，P.，Boyaval，P。and Hols，P。（2010）。开发基于自然转化的多功能程序，用于链球菌的无标记靶向基因修饰嗜热菌。 Appl Environ Microbiol 76（23）：7870-7877。
Fontaine，L.，Wahl，A.，Flechard，M.，Mignolet，J。和Hols，P。（2015）。调节链球菌自然转化的能力。感染Genet Evol 33：343-360。
Goel，A.，Santos，F.，Vos，W。M.，Teusink，B。和Molenaar，D。（2012）。用于测量乳酸乳球菌酶活性的标准化分析培养基，同时模拟细胞内条件。 Appl Environ Microbiol 78（1）：134-143。
Håvarstein，L。S.，Coomaraswamy，G。和Morrison，D。A.（1995）。未经修饰的十七肽信息素可诱导肺炎链球菌的遗传转化能力。; Proc Natl Acad Sci USA 92（24）：11140-11144。
Horton，R.M.，Cai，Z.L.，Ho，S.N。和Pease，L.R。（1990）。通过重叠延伸进行基因剪接：使用聚合酶链式反应定制基因。 ; Biotechniques 8（5）：528-535。
Johnston，C.，Martin，B.，Fichant，G.，Polard，P。和Claverys，J.P。（2014）。细菌转化：分布，共享机制和发散控制。 Nat Rev Microbiol 12（3）：181-196。
Kleerebezem，M.，Beerthuyzen，M。M.，Vaughan，E。E.，de Vos，W。M. and Kuipers，O。P.（1997a）。乳酸菌的受控基因表达系统： Lactococcus的可转移的乳链菌肽诱导表达盒， Leuconostoc 和 Lactobacillus spp。 Appl Environ Microbiol 63（11）：4581-4584。
Kleerebezem，M.，Quadri，L.E.，Kuipers，O。P. and de Vos，W。M.（1997b）。通过肽信息素和革兰氏阳性细菌中的双组分信号转导系统进行群体感应。 Mol Microbiol 24（5）：895-904。
Mierau，I。和Kleerebezem，M。（2005）。乳酸乳球菌中乳酸链球菌素控制的基因表达系统（NICE）10年。 Appl Microbiol Biotechnol 68（6）：705-717。
Mulder，J.，Wels，M.，Kuipers，O.P.，Kleerebezem，M。and Bron，P。A.（2017）。通过诱导能力调节剂ComX释放乳酸乳球菌的自然能力。 Appl Environ Microbiol 。
Otto，R.，ten Brink，B.，Veldkamp，H。和Konings，W。N.（1983）。 Streptococcus cremoris 的生长速率与电化学质子梯度之间的关系。; FEMS Microbiol Lett 16（1）：69-74。
Pestova，E。V.，Havarstein，L。S.和Morrison，D。A.（1996）。通过自身诱导调节肺炎链球菌遗传转化的能力肽信息素和双组分调节系统。 Mol Microbiol 21（4）：853-862。
Poolman，B。和Konings，W。N.（1988）。乳酸链球菌和 Streptococcus cremoris的生长关系到氨基酸转运。 J Bacteriol 170（2）：700-707。
Seitz，P。和Blokesch，M。（2013）。与致病性和环境革兰氏阴性菌的自然能力和转化相关的线索和调节途径。 FEMS Microbiol Rev 37（3）：336-363。
Wells，J.M.，Wilson，P.W。和Le Page，R.W。（1993）。改进的乳酸乳球菌的克隆载体和转化程序。 J Appl Bacteriol 74（6）：629-636。