材料和试剂

0.22μm过滤器（33 mm - Merck，Millex，目录号：SLGP033RS）
文化板块
6口井（Corning，Falcon ®，目录号：353046）
24口井（Corning，Falcon ®，目录号：353047）
96口井（Corning，Falcon ®，目录号：353072）
35毫米培养皿（Corning，Falcon ®，目录号：353001）
50毫升无菌锥形塑料管（Corning，Falcon ®，目录号：352070）
盖玻片13 mm＃1（Thermo Fisher Scientific，目录号：1014355113NR1）
微量吸头提示
1,000μl吸头（SARSTEDT，目录号：70.762.211）
200μl吸头（SARSTEDT，目录号：70.760.211）
10μl吸头（SARSTEDT，目录号：70.1130.210）
硝酸纤维素膜（Sartorius，Stedim Biotech，目录号：11306-41BL）
塑料巴斯德吸管（LP ITALIANA，目录号：133030）
血清学塑料移液器：
5毫升塑料移液器（Corning，Falcon ®，目录号：357543）
10毫升塑料移液器（Corning，Falcon ®，目录号：357551）
25毫升塑料移液器（Corning，Falcon ®，目录号：357525）
一次性灭菌剂0.22μm过滤器Express TM Plus（默克，目录号：SCGPU0SRE）
无菌手术刀（CHEMIL，目录号：11230028）
出生后第4-6天的小鼠或大鼠（任何性别）
蒸馏的H 2 O
乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：46139）
聚-L-赖氨酸氢溴酸盐溶液（Sigma-Aldrich，目录号：P8920）
酚红（Sigma-Aldrich，目录号：P3532）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P5405）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S3014）
D - （+） - 葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G7528）
磷酸二氢钠一水合物（NaH 2 PO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：S3522）
KH 2 PO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：P5655）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
氯化钙二水合物（CaCl 2 ·2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C3306）
硫酸镁七水合物（MgSO 4 ·7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：63138）
不含脂肪酸的牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：A7030）
来自猪胰腺的胰蛋白酶（Sigma-Aldrich，目录号：T4799）
来自大豆的胰蛋白酶抑制剂（Sigma-Aldrich，目录号：T9003）
完整的 TM Mini，不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，Roche Diagnostics，目录号：04693159001）
台盼蓝溶液，0.4％（Thermo Fisher Scientific，目录号：15250061）
来自牛胰腺的脱氧核糖核酸酶I（Sigma-Aldrich，目录号：D5025）
Basal Medium Eagle（BME）（Thermo Fischer Scientific，Gibco TM ，目录号：21010046）
Glutamax TM 补充剂（Thermo Fischer Scientific，Gibco TM ，目录号：35050061）
庆大霉素溶液（Sigma-Aldrich，目录号：G1272）
胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷（AraC）（西格玛奥德里奇，目录号：C1768）
胎牛血清（FBS）（EUROCLONE，目录号：EUS 028877）
注意：更换血清批次或供应商时需要进行文化优化的比较测试。
Trizma ®碱（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
Trizma ®盐酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：T3253）
甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：G8898）
十二烷基硫酸钠（SDS，Sigma-Aldrich，目录号：L3771）
溴酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：B0126）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G9012）
2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M6250）
NuPAGE TM 12％Bis-Tris凝胶（赛默飞世尔科技，目录号：NP0341BOX）
NuPAGE TM 4-12％Bis-Tris凝胶（赛默飞世尔科技，目录号：NP0321BOX）
NuPAGE TM MES SDS运行缓冲液（20x）（Thermo Fisher Scientific，目录号：NP0002）
NuPAGE TM MOPS SDS运行缓冲液（20x）（Thermo Fisher Scientific，目录号：NP0001）
甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：322415）
Ponceau S（Sigma-Aldrich，目录号：P3504）
乙酸（Sigma-Aldrich，目录号：45726）
Tween 20 ®（Sigma-Aldrich，目录号：P9416）
Anti Syntaxin-1A / 1B抗体（自制）
抗BoNT / A切割的SNAP-25抗体（自制）
抗BoNT / B-TeNT切割的VAMP2抗体（自制）
抗BoNT / E切割的SNAP-25抗体（自制）
抗SNAP-25抗体（SMI81，Abcam，目录号：ab24737）
Anti-Syntaxin1抗体（Synaptic System，目录编号：110 011）
抗VAMP-2抗体（Synaptic System，目录号：104 211）
多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
氯化铵（Sigma-Aldrich，目录号：A9434）
荧光封固剂（Agilent Technologies，Dako，目录号：S3023）
HRP-缀合或荧光缀合的二抗（任何供应商）
十二烷基硫酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：74255）
破伤风神经毒素和肉毒杆菌神经毒素。我们实验室中使用的神经毒素如前所述（Schiavo和Montecucco，1995; Shone和Tranter，1995）进行纯化或重组生成（Bade et al。，2004; Zanetti et al。，2017）
Krebs解决方案（10x）（见食谱）
155mM MgSO 4 储备溶液（参见配方）
12.2 mM CaCl 2 储备液（参见食谱）
解决方案A（见食谱）
解决方案B（见食谱）
解决方案C（见食谱）
解决方案D（见食谱）
解决方案E（见食谱）
聚L-赖氨酸溶液（见食谱）
BME完全培养基，CGN培养基（见食谱）
胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷（AraC）储备液（见食谱）
PBS（见食谱）
PBST（见食谱）
SDS-PAGE样品上样缓冲液（4x）（见食谱）
转移缓冲区（见食谱）
Ponceau S解决方案（见食谱）
阻塞缓冲区（见食谱）
4％多聚甲醛溶液（见食谱）
淬火解决方案（见食谱）
渗透稳定解决方案（见食谱）
阻止解决方案（见食谱）

设备

微量移液器（任何供应商）
移液器控制器（任何供应商）
用于锥形管的离心机（Eppendorf，型号：5804 R）
解剖罩（任何供应商）
解剖立体显微镜（OPTIKA显微镜，型号：SZM-LED2）
无菌层流罩（任何供应商）
血细胞计数器（任何供应商）
加湿培养箱（5％CO 2 在37°C）（任何供应商）
冰桶和冰
剪刀＃1（Rudolf Medical GmbH，目录号：RU 2675-18）
镊子＃2（Rudolf Medical GmbH，目录号：RU 7584-16）
剪刀＃3（Rudolf Medical GmbH，目录号：RU 2246-09）
镊子＃4（Rudolf Medical GmbH，目录号：RU 4240-05）
迷你凝胶罐（赛默飞世尔科技目录号：A25977）
Mini Trans-Blot ® Cell（Bio-Rad Laboratories，目录号：1703930）
Thermoblock（任何供应商）
热固性水浴（37°C）（任何供应商）
涡旋混合器（任何供应商）
落射荧光或共聚焦显微镜：Leica CTR6000配备X5 N PL AN（徕卡显微系统，型号：Leica CTR6000）
0.12，x20 N PL AN 0.40物镜或Leica SP5分别配备100x HCX PL APO NA 1.4物镜（Leica Microsystems，Wetzlar，Germany）

程序

培养小脑颗粒神经元（CGN）
1. 在制备前至少1小时准备聚L-赖氨酸包被的24孔板。
  注意：
  1. 根据实验设计，可以使用不同的细胞培养板（6,12,24,96孔）或培养皿。
  2. 分别用6,12,24,96孔细胞培养板的1,000,500,250,50μl聚-L-赖氨酸溶液覆盖。在室温下孵育至少2小时。
  3. 必须吸出聚L-赖氨酸溶液，并在细胞铺板前干燥板/盘/盖玻片（参见步骤A8，注b）。
2. 用70％乙醇擦拭引擎盖的解剖区域和用于解剖的立体显微镜。在解剖罩下，将2.5毫升冷溶液A加入两个35毫米塑料培养皿中，并置于冰桶中冰块中。以下使用的手术工具必须是无菌的。
3. 用70％乙醇擦拭幼仔的头部，用剪刀＃1断头安乐死。使用钳子＃2抓住小狗的头部（图1A），用剪刀＃3去除覆盖头骨和头部基部肌肉的皮肤（图1B）。
4. 使用第二把剪刀＃3（清洁，即不用于剥皮以避免污染），将头骨切开半球区域（图1C中的白色圆圈）并沿着矢状面切割颅骨缝合（图1C和2A中的黑色虚线）直到用耳间线截取（图1C和图2A的白色虚线迹线）。到达那里后，沿着耳间线沿两个方向垂直切割，直到声学 meati （图2A底部的白色箭头），以产生顶骨的冠状开颅术。抬起骨头以发现中脑，小脑和脑干的一部分（左上角的青色虚线图2B）。切开矢状（图2B右上方的黑色虚线），直到枕骨大孔，不会损伤小脑。用一对镊子＃4（图2B的左下图）拉出两个“骨盖”。结果，中脑，小脑和脑干完全暴露（图2B的右下图）。
  
  图2.揭开小脑区域的开颅术
5. 使用第二对钳子＃2（清洁，即，与用于抓住幼犬脸部的钳子不同），轻轻地从半球中分离中脑（图3A）。通过在中脑和半球之间引入钳子＃2（图3A）并通过拧紧镊子末端切割它们之间的连接来实现该步骤。然后，使用与勺子相同的镊子，轻轻抓住中脑，小脑和脑干（图3B）并将它们转移到35毫米塑料培养皿中，该培养皿中装有2.5毫升冰冷的溶液A（图3C）。
  
  图3.中脑，小脑和脑干的分离。虚线点出小脑中脑和脑干。
6. 在解剖显微镜下，使用一对镊子＃4来固定脑干和第二对镊子＃4以从小脑中取出脑膜，直到它呈现出乱蓬蓬的白色外观。用镊子＃4轻轻地将小脑与脑干分开并将其移入新鲜的35mm塑料培养皿中，该培养皿装有2.5ml冰冷的新鲜溶液A以保持在冰上（图4A）。重复此程序最多5小脑。
  注意：
  1. 必须在颈部根部进行斩首以避免小脑损伤。
  2. 每次解剖一只小狗并尽量缩短解剖时间以避免神经元死亡。
  3. 脑膜分支的血管非常有用于发现脑膜，因为它们是红色的并且沿着整个包裹物运行，形成可见的网络。可以用镊子抓住较大的血管并拉动以除去脑膜。一旦熟练，用户可以利用这个技巧快速剥离大部分脑膜包裹，以加快这一步骤。
  4. 为每个小脑使用新鲜的溶液A.
7. 取出溶液A，收集（图4A）并用无菌手术刀切碎小脑（图4B）。
  注意：通过手术刀的重复上下移动进行切碎。手术刀刀片必须锋利，以便对组织产生明显的切口，从而限制神经元的损伤。必须避免使用“研杵”切碎（非锋利的手术刀），因为它可能导致神经元死亡。
8. 使用少量预热的溶液B（~1 ml）和无菌塑料巴斯德吸管，收集切碎的小脑并将其转移到50 ml塑料管中，剩余溶液B，并在37°C孵育15-30分钟，每2-3分钟轻轻旋转一下（图4C）。
  注意：
  1. 对于3小脑，在37°C下15分钟就足够了;建议使用更多小脑（4-5）25-30分钟。
  2. 在此孵化期间，在无菌层流罩下通过抽吸除去聚-L-赖氨酸，让平板干燥。
  图4.小脑切碎和胰蛋白酶消化
9. 加入10毫升溶液D，在室温下以300 x g 离心2分钟。
10. 在无菌层流罩中，小心丢弃上清液，不要丢失小脑组织。
11. 向沉淀的小脑中加入3ml溶液C，并使用无菌P1000（1,000μl）微量移液管以20-30个移液器冲程机械解离组织。
  注意：
  1. 在移液前，溶液是透明的，周围有大的组织聚集体（图5A）。移液后，由于解离的细胞进入悬浮液，溶液变浑浊（图5B）。
  2. 可能存在一些未消化的组织碎片。在继续之前让他们安顿下来。＆nbsp;
12. 使用P1000（1,000μl）微量移液管，收集细胞悬浮液（每次900μl），避免未解离的组织碎片（图5C），并将其转移到新的无菌50ml锥形管中，加入等体积的溶液E.
  
  图5.机械破坏和神经元恢复
13. 第二次重复步骤A11-A12。
14. 在室温下将细胞悬浮液在300 x g 下离心8分钟。
15. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于10 ml预热（37°C）培养基中。
16. 用血细胞计数器计数解离的神经元，并以所需的密度平板。
  注意：
  1. 每个小脑的典型产量约为20-25百万（大鼠）和10-15百万（小鼠）神经元。
  2. 产量较低可能是由于i）胰蛋白酶化效率低：延长步骤A6的孵育时间; ii）由于过度胰蛋白酶消化和/或过于刺激的机械组织破坏导致的神经元死亡：步骤A8的孵育时间缩短和/或降低胰蛋白酶浓度，和/或在步骤A11中机械解离期间更温和。
  3. 台盼蓝（渗透死细胞，不被健康细胞吸收）可用于更准确的细胞计数。
  4. 平板神经元的最小密度为1.5 x 10 5 细胞/ cm 2 （即，24孔培养板中的3.0×10 5 细胞）。该密度适用于成像实验。对于生物化学（蛋白质印迹），推荐的密度为2 x 10 5 细胞/ cm 2 （即，24孔培养板中的4.0 x 10 5 细胞），但应根据计划的实验设定最佳密度。
  5. 在较低密度下，神经元网络的成熟较慢，活力较低，细胞倾向于形成团块。
17. 在37°C孵育并且5％CO 2 。接种后18至24小时，加入胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷（araC）至终浓度10μM，以阻断非神经细胞的生长。
  注意：
  1. araC通过阻断非神经元细胞的增殖，使CGNs培养成几乎纯的神经元培养物。
  2. araC的浓度提示阻断非神经元细胞的增殖而不会引起可检测的CGN应激/死亡。
  3. 可以使用不含araC的培养基，但是即使在无血清培养基中培养，CGN也会在较长的DIV中被非神经元细胞超支（Wong et al。，2001）。
18. 在37°C孵育并且5％CO 2 。根据细胞密度，神经元成熟需要5至6天体外（DIV）。从DIV 5-6开始，神经元培养适用于测试梭菌神经毒素。图6显示DIV 6处的成熟神经元。
  注意：
  1. 当神经元形成一个厚厚的神经元过程网络时，必须认为培养是成熟的。通常，培养物适用于DIV 5-6。
  2. 当神经元分组形成扣环时，不应使用培养物。根据我们的经验，这是细胞压力的标志。
  3. 培养基血清批次的变异性强烈影响培养成熟和神经元活力。建议将多个血清批次的比较试验用于培养优化。
  图6. DIV 6处的成熟CGN。比例尺=10μm。
Western blotting研究CNT活性
1. 在培养基中的预期浓度下制备梭菌神经毒素。根据实验设计，典型浓度范围从低pM到nM。通过用补充有毒素的新鲜预热培养基替换培养基来使培养的CGN中毒。
  注意：
  1. CNT浓度，时间和孵育方案几乎不影响进入神经元的毒素分子的数量，因此影响SNARE的整体切割。通常，脉冲孵育允许在整个实验期间进入比离开毒素更少的分子。因此，脉冲孵育对SNARE蛋白的切割较慢。
  2. 脉冲实验可以通过在冰冷的毒素培养基中培养神经元来完成，以使CNT与神经元结合而不是内化。添加新鲜的37°C预热，培养基将以同步方式引发毒素内化。
  3. 更换培养基（去除后加入新鲜培养基）至关重要，必须小心谨慎，以免神经元受损或脱落。
  4. 如果使用不同的介质进行中毒，请注意CNT进入神经元受到严重依赖钙（至少1-2 mM）的神经元活动的强烈影响。去极化条件，如高K + ，显着增加毒素进入（和毒性）。 CGN的培养基含有~1.6mM的钙并且稍微去极化（25mM K + ），使CNT自身内化。对于短脉冲中毒（37°C下5-10分钟），K + 浓度可升至90 mM。可以进行CGN中基础钾的中毒，但是短时间的孵育，因为培养中缺乏高钾的这些神经元会发生凋亡（D'Mello等，1993）。
  5. 虽然体外毒素活性不是必需的，但体内细胞外液含有血清。因此，使用补充有血清的培养基的中毒可以被认为更类似于CNT自然起作用的环境。
2. 根据实验设计延长孵育时间。
  注意：CNT是金属蛋白酶（酶），因此孵育时间越长，SNARE底物的裂解就越有效。
3. 吸出培养基，用盐水溶液（PBS很好）冲洗神经元，并使用LSB（Laemmli Sample Buffer 1x）将细胞直接裂解到孔中。
  注意：必须根据神经元密度和平板表面设置LSB体积。我们通常使用25μl/ 4.0×10 5 细胞（24孔培养板）。
4. 将细胞裂解物收集到1.5ml管中，并在100℃下使蛋白质热变性至少15分钟。
5. 通过SDS-PAGE分离蛋白质。
  注意：
  1. 我们按照制造商的说明常规使用Thermo Fischer Scientific的SDS-PAGE缓冲液和试剂。对于BoNT / A和BoNT / C，我们使用NuPAGE TM 12％Bis-Tris凝胶和1x MOPS运行缓冲液（70 V直至运行前端离开凝胶）。对于BoNT血清型和TeNT切割VAMP，推荐使用NuPAGE TM 4-12％Bis-Tris凝胶和1x MES运行缓冲液（200 V，~1 h）。这些参数可以变化并且可能需要优化，这取决于所使用的SDS-PAGE凝胶，特别是从完整的SNAP-25中分离BoNT / A-和BoNT / C-截短的SNAP-25，其分子量相差小于2kDa。
  2. 可以加载预先染色的蛋白质标准品以估计条带分离的进展。
6. 将蛋白质转移到适合Western印迹的基质上。
  注意：我们使用硝酸纤维素和含有20％甲醇的转移缓冲液。
7. 通过Ponceau S染色检查蛋白质转移（可选）。
8. 使用PBST进行大量洗涤，对Ponceau S进行去污。
9. 使用封闭缓冲液在室温下将膜封闭1小时。
10. 将膜与封闭缓冲液中指定稀释的一抗孵育过夜。
  注意：我们常规使用以下针对SNARE蛋白的一抗：抗VAMP-2（1：2,000，Synaptic System，104 211），抗SNAP-25（1：5,000，SMI81，Abcam，ab24737），抗syntaxin -1A（1：2,000，Synaptic System，110 011），抗BoNT / B-TeNT切割的VAMP-2（1：200，自制），抗BoNT / A切割的SNAP-25（1：5,000，自制），抗BoNT / E-cleaved SNAP-25（1：5,000，自制）和抗syntaxin-1A / 1B（1：2,000，自制）。先前已经报道了自制抗体的表征（Antonucci等人，2008; Antonucci等人，2009; Pirazzini等人，2014; Azarnia Tehran等人，2015）。
11. 用PBST洗涤膜三次，每次5分钟。将膜与适当的二抗在PBST中孵育1小时。
  注意：我们经常使用HRP偶联的二抗。然而，使用不同的开发系统（和适当的二抗），如LI-COR Biosciences的Odyssey成像系统，已经获得了可比较的结果。
12. 用PBST洗涤膜三次，用PBS洗涤两次，每次5分钟。用适当的显影系统（根据所用的二抗）开发膜。
通过成像研究CNT活动作为Western印迹分析的替代，可以使用通过免疫荧光分析接种在玻璃盖玻片上的CGN来评估CNT活性。虽然这种方法很敏感，但这种分析必须被认为是定性的而不是定量的。
1. 中毒后（步骤B1-B2前一段），吸出培养基，用PBS冲洗神经元，并在室温下使用4％多聚甲醛溶液固定神经元15分钟。
2. 用PBS洗涤神经元两次，并使用猝灭溶液淬灭多聚甲醛20分钟。
3. 去除猝灭溶液并用透化溶液在-20℃下透化20分钟。
4. 去除透化溶液并用封闭溶液在室温下饱和细胞30分钟。
5. 在封闭溶液中加入一抗，并使用37℃的潮湿室孵育至少2小时或在4℃下孵育过夜。
  注意：
  1. 用于蛋白质印迹的一抗也可用于成像。
  2. 未经处理（使用CNT）样品必须始终包含在实验设计中。
  3. 建议仅使用二抗的对照评估二抗的非特异性结合。
6. 用PBS清洗神经元至少三次。
7. 在封闭溶液中使用荧光标记的二抗检测一抗。使用潮湿的室在37°C下孵育45分钟。
8. 用PBS洗涤神经元三次。
9. 使用荧光安装介质安装盖玻片。
  使用带有适当滤光片的荧光显微镜收集图像。共聚焦显微镜更合适，但用落射荧光显微镜也可获得令人满意的结果。
使用CGN作为筛选CNT抑制剂的平台
1. 使用5-6DIV的CGNs，其接种在24孔板中，密度至少为4.0×10 5个神经元。
2. 制备待测化合物的储备溶液，然后在培养基中进行连续稀释。
  注意：
  1. 我们通常每孔准备500μl化合物溶液，并一式三份测试每种浓度。
  2. 可以使用不同的培养基来制备化合物稀释液。我们更倾向于使用培养基将神经元保持在它们生长的相同培养条件下，避免额外的压力。此外，培养基含有血清，有助于溶解水溶性差的化合物，避免使用过量的有机溶剂。
3. 用抑制剂溶液替换培养基。
  注意：
  1. 用新鲜培养基补充等量的用于制备抑制剂储备溶液的载体（例如乙醇，二甲基亚砜等）进行对照条件。
  2. 建议预孵育（在中毒前添加抑制剂）以确定测试化合物是否实际上有效作为抑制剂。该初步测定之后应进行进一步的实验，旨在了解中毒过程的哪个阶段被抑制。这可以通过在不同的中毒阶段加入推定的抑制剂来进行：i）在中毒前与化合物预温育; ii）将化合物与毒素一起加入细胞中; iii）中毒后加入化合物; iv）中毒后不同阶段加入化合物。
  3. 预孵育时间可能因抑制剂的不同参数而异：物理化学性质，神经元膜通透性，化合物的分子靶标等。
  4. 必须考虑有效浓度范围和对神经元可能的内在毒性。
  5. 评估推定的抑制剂的稀释剂（例如乙醇，二甲基亚砜等）是否必须包含CNT的控制条件。
  6. 由于间接作用，化学化合物可以改变神经元生理和阻断毒素活性/摄取。这应该通过适当的实验来测试，该实验取决于推定的抑制剂的性质。
4. 根据实验设计添加所需浓度的毒素并延长孵育时间。
  注意：
  1. 应测试几种浓度的抑制剂以达到剂量 - 反应曲线。
  2. 毒素可以作为脉冲添加或在整个实验期间保留（参见步骤B1和B2）。
  3. 可以同时添加多个CNT（针对不同的SNARE底物），以研究共享抑制机制的可能性。
5. 如果毒素作为脉冲给出，毒素洗掉后恢复具有所需浓度的抑制剂的培养基并根据实验设计延长孵育时间。
  注意：
  1. 在这种情况下，准备（在步骤D2中）含有所需浓度的抑制剂或载体的双倍量培养基。
  2. 孵育时间对SNARE蛋白质切割和抑制剂功效也有显着影响。
6. 从步骤B1（WB协议）或前面段落的步骤C1（成像协议）继续。

数据分析

CNT以非常高的选择性切割SNARE蛋白。每种毒素不仅水解一种特定的SNARE，而且还切割非常特异的肽键（Pirazzini et al。，2017）（图7A）。这是由于CNT蛋白酶和涉及活性位点和许多外源的SNARE蛋白之间发生多重和选择性相互作用（Binz，2013; Rossetto et al。，2014; Pirazzini et al。，2017）。 SNARE蛋白内的切割位点在脊椎动物中非常保守，包括人类（Carle 等人，，2017）。同时，甚至肽键中的单个突变或介导毒素 - 底物识别的外显子也使得SNARE蛋白不可切割，携带这种改变的脊椎动物对该特定毒素不敏感（Patarnello et al。，1993; Eleopra et al。，2013; Peng et al。，2014）。
通过蛋白质印迹和使用特异性抗体的成像，这种特异性使得易于解释中毒CGN的结果。图7B显示了Western印迹膜的图解，其中模拟了最流行的抗体的使用。根据CNT，可以通过跟踪SNARE蛋白质条带的染色来清楚地评估毒素活性。

图7. SNARE蛋白上CNT活性的模式化（A）和使用指定抗体（B）模拟蛋白质印迹结果。请注意，这些结果可以通过理想地切割50％的SNARE蛋白来实现（S）。 NC是“阴性对照”并且对应于未用CNT处理的样品中指示的SNARE蛋白的正常电泳迁移率和条带强度。灰色条带表示该条带的强度降低（~50％）。 Syntaxins-1A / 1B由CGN同时表达并显示为双峰，因为尽管分子量非常相似（~33kDa），但是当通过SDS-PAGE分离时，syntaxin-1A和syntaxin-1B略有不同。由于BoNT / C同时切割stx-1A和stx-1B，它会生成右边最后一个面板中显示的4波段模式。

图8显示了典型的Western印迹结果。虽然蛋白质印迹法是一种半定量分析，但是利用现代开发技术和仪器，可以通过波段密度测定法准确地确定CNT活性（或抑制）。

图8.通过蛋白质印迹研究CNT活性。所示图像是代表性实验，其中CGN用不同血清型的BoNT处理。 A.在每个小组中显示两个样品：未用毒素处理（不含毒素，未处理的细胞，左）和另一个用指定的BoNT血清型（右）处理的样品。使用的抗体是：抗syntaxin1A，抗SNAP-25和抗VAMP-2。 BoNT / B，/ D，/ F和/ G切割VAMP-2导致VAMP-2信号消失。 BoNT / A和BoNT / E切割SNAP-25，导致SNAP-25 C-末端片段的出现。相反，BoNT / C水解Syntaxin 1A / 1B和SNAP-25，导致两种产生的片段出现。 B.SNAP-25-BoNT / A-切割的抗体在BoNT / A切割后识别产生的C-末端片段。该抗体针对BoNT / A切割后新产生的C末端产生，并且不与完整的SNAP-25交叉反应。 C.VAMP-2 BoNT / B切割的抗体在BoNT / B切割后识别产生的N-末端片段。定量解释关键取决于开发技术，二级抗体类型和所用检测系统的线性动态范围。

VAMP-2 BoNT / B切割的抗体和SNAP-25-BoNT / A切割的抗体也可用于染色神经元以在固定的神经元中成像CNT活性。图9显示了一些例子。

图9.通过成像研究CNT活性。用载体（无毒素）或用指定的BoNT血清型处理CGN 2小时。固定神经元并用针对BoNT / E切割的SNAP-25（左图）或BoNT / A切割的SNAP-25（右图）和VAMP2的抗体染色作为管家染色。用Alexa555偶联的二抗检测BoNT / A和BoNT / E切割的-SNAP25，而用Alexa488二抗检测VAMP2。 DAPI用于染色细胞核。比例尺=10μm。

食谱

克雷布斯解决方案（10x）

调节至pH 7.4并使用0.20μm过滤器过滤。可将该溶液等分（每次50ml）并储存在-20℃直至进一步使用（稳定至少三个月）
155mM MgSO 4 储备溶液
制备155 mM MgSO 4 溶液：
1. 将1.91克MgSO 4 ·7H 2 O溶于50毫升蒸馏水中 2 O
2. 使用0.20μm过滤器在层流罩中过滤溶液，并保持在4°C（稳定至少两个月）
12.2 mM CaCl 2 原液
制备12.2 mM CaCl 2 溶液：
1. 将0.09克CaCl 2 ·2H 2 O溶于50毫升蒸馏水中 2 O
2. 使用0.20μm过滤器在层流罩中过滤溶液，并保持在4°C（稳定至少两个月）
解决方案A

使用一次性灭菌器在层流罩中过滤溶液。可将该溶液等分（每次50ml）并储存在-20℃直至进一步使用（稳定至少三个月）
解决方案B.
1. 在12.5ml溶液A中加入0.01g胰蛋白酶
2. 使用0.20μm过滤器在层流罩中过滤溶液
注意：始终准备新鲜的。
解决方案C.
1. 在15 ml溶液A中加入120μlDNA酶（10 mg / ml，储备液），7.8 mg胰蛋白酶抑制剂和150μl155mM MgSO 4 储备液。
2. 使用0.20μm过滤器在层流罩中过滤溶液
注意：始终准备新鲜的。
解决方案D
将2.4毫升溶液C与12.6毫升溶液A混合
注意：始终准备新鲜的。
解决方案E.
1. 在15 ml溶液A中加入120μl12.2mM CaCl 2 储备液和120μl155mM MgSO 4 储备液。
2. 在层流罩中过滤溶液，称为0.20μm过滤器
注意：始终准备新鲜的。
聚L-赖氨酸溶液
准备聚L-赖氨酸的储备溶液，范围为5-10 mg / ml
工作浓度为50μg/ ml
BME完全培养基，CGN培养基

使用一次性灭菌器过滤层流罩中的介质。介质可以在4°C下储存（稳定至少一个月）
胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷（AraC）储备液
1. 在5毫升蒸馏水中加入4.9毫克胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷（1毫克/毫升，4毫克）
2. 在37°C孵育几分钟并涡旋直至溶液看起来清澈无色
3. 使用0.20μm过滤器在层流罩中过滤
注意：此溶液可以等分并储存在-20°C（稳定至少一年）。
PBS
NaCl 137 mM
KCl 2.7 mM
Na 2 HPO 4 10 mM
KH 2 PO 4 1.8 mM
PBST
PBS补充0.1％（v / v）Tween 20
Laemmli样品缓冲液。配方为10毫升（4x）
2.5毫升1M Tris-HCl（pH6.8）：
1克SDS
0.8毫升0.1％溴酚蓝
4毫升100％甘油
2毫升14.3毫升β-巯基乙醇
4片蛋白酶抑制剂
用蒸馏水 2 O将最终体积调节至10 ml
转移缓冲区
要制作10x传输缓冲区：
1. 溶解288克甘氨酸和60.4克Tris碱，加入蒸馏的H 2 O至最终体积为2L
2. 制备1x转移缓冲液混合物700ml蒸馏水H 2 O，200ml甲醇和100ml 10x转移缓冲液
Ponceau S解决方案

阻塞缓冲区
PBST中5％脱脂奶粉
4％多聚甲醛溶液
1. 将450ml蒸馏的H 2 O置于玻璃烧杯中，并在搅拌下使用热板在60℃加热
2. 加入20克多聚甲醛
3. 然后，加入5滴2N NaOH，等待溶液变澄清（几分钟）
4. 从热源中取出并加入50毫升10倍PBS并调节pH至7.4
5. 使用0.2μm过滤器和等分试样过滤
注意：4％多聚甲醛溶液可在-20°C冷冻。
淬火解决方案
PBS中加入50 mM氯化铵
透化解决方案
纯乙醇中含5％乙酸
储存在-20°C
阻止解决方案
PBS中2.5％BSA

致谢

这项工作得到了帕多瓦大学的支持，并向国会议员提供了DOR。 DAT目前由Alexander von Humboldt（AvH）博士后研究员研究奖学金支持。所有程序均在由生物医学科学系（帕多瓦大学）的Cesare Montecucco教授领导的“神经毒素，神经麻痹和再生”实验室中进行了优化。制备CGN的方法改编自Anne Messer和Parizad M. Bilimoria 等先前的工作。作者宣称没有相互竞争的利益。 MP和DAT以同样的贡献撰写了这篇论文。

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