材料和试剂

2毫升螺旋盖锥形管（Thermo Fisher Scientific，目录号：3462）
玻璃珠，酸洗425-600微米（Sigma-Aldrich，目录号：G8772-10G）
0.5 ml PCR管（Eppendorf，目录号：0030124537）
1.5毫升试管（Eppendorf，目录号：022363204）
15和50ml Falcon TM管（Corning，目录号：352070）
DynaMag TM TM-2 Magnet（Thermo Fisher Scientific，目录号：12321D）
Synechocystis sp。在BG11 0C琼脂（Stanier等人，1971）的平板上生长的PCC 6803细胞。
NH 4 Cl（Sigma-Aldrich，目录号：254134）
TES（Sigma-Aldrich，目录号：T1375）
37％甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：F8775）
甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：50046）
NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S7653-250G）
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：E9884）
琼脂糖（NZYTech，目录号：MB02702）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
脱氧胆酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：30970）
蛋白酶抑制剂鸡尾酒片SIGMAFAST（西格玛奥德里奇，目录号：S8820-2TAB）
NP-40（Sigma-Aldrich，目录号：74385）
LiCl（Sigma-Aldrich，目录号：L9650）
抗NtcA抗体（Giner-Lamia等人，2017）
SDS（Sigma-Aldrich，目录号：L3771）
BSA（Sigma-Aldrich，目录号：B4287）
无DNA酶的RNA酶A溶液（赛默飞世尔科技，产品目录号：EN0531）
蛋白酶K（Thermo Fisher Scientific，目录号：25530049）
苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）（Sigma-Aldrich，目录号：P2069）
CaCl 2（Sigma-Aldrich，目录号：449709）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
MnCl 2·4H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：221279）
ZnSO 4·7H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：Z1001）
Na 2 MoO 4·2H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：331058）。
CuSO 4（PubChem，目录号：24462）
Co（NO 3）2·6H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：239267）
MgSO 4·7H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：63138）
CaCl 2·2H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：223506）
柠檬酸（Sigma-Aldrich，目录号：251275）
Na 2 -EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：27285）
Na 2 CO 3（Sigma-Aldrich，目录号：S1641）
Fe-NH 4柠檬酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：F5879）
硼酸，H 3 BO 3（Sigma-Aldrich，目录号：B6768）
100％冷冻冷藏乙醇
MiniElute PCR纯化试剂盒（QIAGEN，目录号：28004）
dsDNA检测试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：Q32851）
SsoFast TM EvaGreen超级混合物（Bio-Rad Laboratories，目录号：172-5200）
Pearce TM蛋白G磁珠（Thermo Fisher Scientific，目录号：88847）
Bradford Protein Assay（Bio-Rad Laboratories，目录号：5000001）
5x Tris缓冲盐水（TBS）缓冲液（见食谱）
裂解缓冲液（见食谱）
块解决方案（请参阅食谱）
清洗缓冲液1（见食谱）
清洗缓冲液2（见食谱）
5倍IP解决方案（请参阅食谱）
Tris-EDTA（TE）+ NaCl溶液（见食谱）
蛋白酶K溶液（见食谱）
痕量金属混合物A5（见食谱）
高压灭菌的BG11 0C中等液体（参见食谱）（Stanier等人，1971）
高压灭菌的BG11 0C + NH 4 4中等液体（参见食谱）（Stanier等人，1971）

设备

微量移液器（1,000,100,20和10μl）
2升烧瓶和2×1升烧瓶
轨道摇床（VWR，型号：3600）
FastPrep-24仪器（MP Biomedicals，产品目录号：116004500）
Eppendorf Thermomixer R混合器，1.5ml块（Eppendorf，型号：ThermoMixer R，目录号：5355）
Eppendorf MiniSpin plus （Eppendorf，型号：MiniSpin plus ）
Eppendorf离心机Falcon（Eppendorf，型号：5810R）
MyCycler TM热循环仪系统（Bio-Rad Laboratories，目录号：1709703）
Sonicator超声波处理器XL（QSonica，型号：XL-2020）
Quibit <2.0>荧光计（Thermo Fisher Scientific，型号： Quibit ® 2.0 ）
CFX Connect实时PCR检测系统（Bio-Rad Laboratories，目录号：1855201）
HiSeq TM 2000 Sequencing System（Illumina）
个人电脑至少具有2 GB的RAM和2 GHz双核处理器，硬盘空间不低于25-50 GB

软件

FastQC（v0.11.5）
（ https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ < / a>）
Bowtie2（v2.3.4.1）
（ http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml [Langmead and Salzberg，2012]）
Samtools（v1.7）
（ http://samtools.sourceforge.net [Li et。，2009年]）
DeepTools（v2.0）
（ http://deeptools.readthedocs.io/en/latest/content/changelog。 html [拉米雷斯等人，2016年]）＆nbsp;
ChIP-Seq（MACS）的基于模型的分析（v1.4.1）
（ http：//liμlμLab.dfci.harvard.edu/MACS/ [Zhang et al。，2008]）
BayesPeak（v1.22.0）
（ http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/BayesPeak。 html [Spyrou et。，2009]）
整合基因组查看器（IGV）（v2.3）
（ http://software.broadinstitute.org/software/igv/ [Robinson ，2011]）
ChIPseeker（v1.6.7）
（ https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/ChIPseeker。 html [Yu et。，2015]）

程序

用于ChIP分析的全细胞提取物的制备（图1）

图1. ChIP实验中的步骤流程图。转录因子（TF），抗体（AB）。
1. 在新鲜平板（小于2周龄）中在液体BG11 0C-NH4中开始从0.5μgChl / ml开始50ml集胞蓝细胞前期培养物，在恒定光照下（45μmol光子/米2秒），在30℃下，在旋转振荡器上进行4次培养。
2. 使用前培养物（2-3μgChl / ml）接种具有500ml BG11C-NH4的2L烧瓶并在相同条件下继续孵育直至细胞达到3-4μg/ ml的叶绿素浓度。
3. 将培养物在两个高压灭菌的离心瓶之间分开，每个瓶含有250ml用于铵（NH 4 +）+和氮耗竭（-N）处理的原始培养物。在室温下将细胞以5,000xg离心5分钟并弃去上清液。对于NH 4 4 + 2，用250ml的BG 1 0 -CO 4 -NH 4 +洗涤沉淀2次，对于-N处理，BG11 <0>和C.在250毫升相应的培养基中重悬沉淀，并将培养物转移到两个1L烧瓶中。
  培养如上培养4小时。
4. 向两种培养物（NH 4 +和-N）中加入6.75ml的37％甲醛以达到1％甲醛的最终浓度（用于交联）。在室温下孵育15分钟，偶尔轻轻摇动。
5. 通过加入12.5ml 2.5M甘氨酸终止交联反应以获得125mM的最终浓度，并在室温下孵育5分钟，偶尔轻微摇动。
6. 将培养物传至两个高压灭菌的离心瓶中，并在4℃下以5,000μg×g的速度离心细胞5分钟。丢弃上清液（含甲醛）到合适的废物容器中。
  用10 ml冷却的TBS缓冲液洗涤沉淀两次
7. 在5000℃下将样品在4℃下旋转5分钟并弃去上清液。对于每个离心瓶，将细胞沉淀重悬于2ml冷的TBS缓冲液中，并将悬浮液分配到两个2ml螺旋盖管中。最后，再次旋下样品并用微量移液器除去剩余的上清液。
8. 可选：此时细胞团块可在液氮中快速冷冻并储存在-80°C。
细胞裂解
注意：如果交联的细胞管储存在-80°C，在继续之前在冰上融化细胞团很重要。
1. 将含有细胞沉淀的试管置于冰上，并将细胞重悬于500μl裂解缓冲液（在4℃预冷）。
2. 加入0.5g酸洗玻璃珠，并在FastPrep-24中使用10次珠磨循环1分钟，在循环之间冰上1分钟。
3. 将试管以4,000×g g离心2分钟，并使用微量移液管小心收集90％的上清液（裂解液）。将所有收集的溶胞产物（大约2.7ml）混合并将其分成2个2ml管（每管约1.35ml）。
  注意：为避免样品被细胞和玻璃珠污染，留下10％的上清液。
4. 超声裂解物，15个循环（10％振幅10秒，循环之间冰上40秒）以将染色体DNA片段化成大小在200和400bp之间的序列。
  注意：这一步对于检索高质量的DNA片段至关重要。超声处理和信号幅度的持续时间必须针对每个设备进行调整，以避免低剪切或过量的DNA剪切。为了优化这一步，我们建议复制我们的设置以剪切新提取的基因组DNA（以避免浪费有价值的样本）。然后，将部分剪切的DNA（5-20μl）加载到琼脂糖凝胶上并检查DNA片段是否集中在400bp左右。调整循环次数和强度以补偿过度或不足的剪切。如果片段主要是＆gt; 400bp，然后逐渐增加振幅或周期数，而如果它们大约< 150 bp，然后减少使用的循环次数。
5. 将超声处理的样品在4℃下以10000×g离心15分钟以除去细胞碎片并将上清液转移到干净的1.5ml微管中。
6. 为了检查剪切后DNA片段的长度分布，将20μl超声处理的样品加入1％琼脂糖凝胶中。您剪切的DNA必须浓缩在200-400 bp左右。
7. 使用Bradford蛋白质测定法收集10-20μl以测量全细胞提取物的蛋白质浓度。
8. 全细胞提取物可以储存在-20°C或立即用于免疫沉淀。
准备用于染色质免疫沉淀的磁珠
1. 每个反应在1.5 ml试管中准备20μlProtein G磁珠（最少2个试管：一个含免疫沉淀（IP）样品珠，另一个含第一次洗涤步骤珠）。
2. 每个试管加入480μl封闭缓冲液至终体积为500μl。
3. 用500μl封闭溶液（通常使用新鲜溶液）通过在1,500gxg离心1分钟来洗涤珠粒并丢弃上清液。重复洗涤两次。在20μl裂解缓冲液中重悬珠。
染色质免疫沉淀和交联反转
1. 在裂解缓冲液中制备500μl浓度为4mg / ml总蛋白的全细胞提取物。将50μl上清液转移到1.5ml管中并储存在-20℃。这是每个ChIP样本的10％总输入DNA（图1）样本。
  注意：输入DNA样本对照包含不会被免疫沉淀的交联和超声处理的DNA。输入DNA在ChIP-seq实验中是一个非常重要的控制因素，因为它将用于标准化来自ChIP富集的信号。通过比较芯片和输入样品之间的读数增加，它还有助于控制实验方法中的偏差。
2. 用20μl磁珠预处理细胞提取物，洗涤以减少DNA或蛋白质与磁珠的非特异性结合。
  在4°C下旋转孵育1小时
3. 用DynaMag™磁力支架收集珠子，并将上清液（500μl）转移至干净的1.5ml管中。
4. 向IP样品中加入2-5μg抗体（取决于抗体;商业抗体参考制造商的ChIP-seq方案）。
5. 在4°C孵育IP样品并旋转过夜（至少16小时）。
6. 向每个IP样品中加入20μl预洗磁珠，并在4°C下旋转孵育2 h。
7. 温育后，使用DynaMag TM磁力架小心弃去上清液，并在室温下用1.5ml裂解缓冲液洗涤磁珠两次，旋转5分钟。
8. 使用清洗缓冲液1，清洗缓冲液2和TE缓冲液重复清洗步骤。
9. 在含有20μg不含DNAse的RNA酶A的100μlTE缓冲液中重悬磁珠，37°C孵育30 min。用1.5毫升TE缓冲液洗珠。
10. 为了洗脱免疫沉淀物质，将磁珠重悬于100μl洗脱缓冲液中，并在65℃孵育30分钟，偶尔涡旋（轻轻地，中等速度）。
11. 重复洗脱步骤并合并两种洗脱液。
12. 在冰上解冻输入样本。加入20μl5x洗脱缓冲液加30μlMilliQ水以达到与洗脱样品相同的缓冲液浓度。
13. 为了逆转交联，在65℃孵育ChIP样品（抗体-IP和输入）5小时。
DNA纯化
1. 向输入样品中加入100μlMilliQ水（达到200μl体积，与IP样品一样）。向所有ChIP样品中加入2μl蛋白酶K至终浓度为0.4μg/μl，并在37°C孵育1.5 h。
2. 用200μl苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）通过涡旋1分钟提取DNA并在4℃下以10000×g离心10分钟。将每次提取的上层相转移到干净的1.5毫升管中。
3. 用200μl氯仿：异戊醇（24：1）重复提取两次。
4. 加入53μl的7.5M NH 4 4 AcO和2体积（500μl）冷冻 - 冷乙醇。
  在-20°C孵育至少2小时（当过夜储存时可达到最佳效果）。
5. 在10000×g离心30分钟，4℃。
6. 取出上清液，用1000μl冷冻冷却的70％乙醇洗涤两次。
7. 空气干燥样品，并将颗粒悬浮在方便量的不含核酸酶的MilliQ水（25-50μl）中。
8. 按照制造商提供的说明，使用Quibit 2.0和Quibit dsDNA测定试剂盒测量ChIP DNA样品的数量和质量。
9. 为了检查在免疫沉淀期间是否实现了潜在的或已知的TF结合区域的富集，可以通过定量实时PCR（qRT-PCR）扩增特定基因组区域的DNA。为了进行这种评估，将2.5μgIP和输入DNA样品加入到每个基因组区域（要研究的基因座）的0.5ml管中，并使用CFX连接RT-PCR仪和ssoFast EvaGreen Supermix试剂盒进行qRT-PCR。 > 注意：这一步是可选的。如果有关已知TF分析目标的信息可用，那么我们鼓励研究人员在构建文库之前通过qRT-PCR分析IP DNA。在我们的研究中，分析了两个众所周知的NtcA结合启动子（glnA和glnB）（Giner-Lamia等，2017）。
10. 按照试剂盒手册中的建议，使用Illumina TruSeq ChIP-seq DNA样品制备试剂盒v.2，使用最少10 ng的IP和Input DNA样品进行文库制备。
  注：如果回收的IP DNA产量低，则可以使用DNA纯化柱（miniElute试剂盒，QIAGEN）汇集来自不同实验的所得IP DNA样品以获得＆gt; 10 ng IP DNA样品。

数据分析

在本节中，我们提供了一个使用NtcA原始数据的子集作为教程准备的ChIP-seq分析示例。这些文件仅包含从NtcA ChIP-seq实验（Giner-Lamia等人，2017）获得的总读数的1％，以确保更快的计算时间。本教程所需的所有材料可在GitHub网站上找到（ https://github.com/ginerorama/NtcA_bio -protocols_tutorial ）。虽然在本教程中仅描述了氮耗尽ChIP-seq文件的命令行，但氮耗尽（-N）和充氮（NH4 +）的中间文件）条件可在GitHub教程页面上找到。如本教程中所述，概述生物信息学ChIP-seq分析的流程图如图2所示。

图2.ChIP-seq生物信息学分析流程的流程图

注意：在本教程中，我们假设您熟悉使用终端界面所需的基本shell命令。

使用FastQC对测序读数进行质量控制分析。在分析序列之前，您应始终对原始序列数据进行质量控制，以识别潜在的伪影。 FastQC（图3）软件包含不同的分析模块，包括：（i）每个碱基的测序质量（分数越高，碱基调用越好;在任何情况下，任何碱基的四分位数应低于10）。（ii）每个碱基序列含量（这应显示每个碱基处核苷酸的非随机分布; A与T之间或G与C之间的差异对于任何位置应不大于10％）;和（iii）重复序列（非独特序列不应占总序列的20％以上）。有关FastQC模块的更多信息，请访问 https://www.bioinformatics.babraham。 ac.uk/projects/fastqc/Help/ 。
注意：虽然FastQC可以使用命令行执行，但它也有一个图形用户界面，便于不熟悉命令行程序的研究人员进行分析。

图3.使用FastQC的质量控制分析。由FastQC在N_input.fastq（A）和N_ChIP.fastq（B）文件中执行的模块化分析组标记为绿色，表示测序数据正确。
读数与基因组的比对。 Synechocystis sp的参考基因组。 PCC 6803可以从国家生物技术信息中心（NCBI）基因组数据库下载，可在 https：/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly 。它具有GenBank组装登录号：GCA_000009725.1; RefSeq：NC_009911.1。在我们的例子中，基因组文件是 NC_009911.1.fasta 。这个基因组文件也可以在GitHub教程页面上找到。对于每个样本，我们使用bowtie2程序将包含序列读数的FastQ文件映射到参考基因组。为此，我们需要使用Bowtie2的bowtie2-build功能创建参考基因组的索引; bowtie2-build输出一组包含后缀（.1.bt2，.2.bt2，.3.bt2，.4.bt2，.rev.1.bt2和.rev.2.bt2）的六个文件。这些文件构成索引。一旦建立了这个指数，原始的基因组序列Fasta文件就不再被Bowtie2使用。现在，我们可以使用默认参数运行Bowtie2。 Bowtie2的输出文件采用序列对齐映射格式（.SAM），并包含所有对齐信息。
在bowtie2中用于索引生成和映射的通用命令行如下所示：

基因组索引生成：
：$ bowtie2-build path_to_genome_reference genome_index

参数：
path_to_genome_reference：包含从NCBI以fasta格式下载的参考基因组的文件的系统路径。
Genome_index：索引文件的基本名称。（Name.1.bt2，Name.2.bt2，Name.3.bt2，Name.4.bt2，Name.rev.1.bt2和Name.rev.2.bt2）

因此，集胞藻基因组的指数由命令生成：

：$ bowtie2-build NC_009911.1.fasta Synechocystis

基因组比对：
：$ Bowtie2 -x basename_genome_index -U sequence_reads.fastQ
-S alignment_file.sam

参数：
- x basename_genome_index：参考基因组索引的基名。在这种情况下，基本名称是任何索引文件的名称，不包括最终的1.bt2 /。或rev.1.bt2 /。
- U sequence_reads.fastQ：包含未配对阅读对象的文件。
- S alignment_file.sam ：用于写入和保存SAM对齐的文件。

在我们的例子中，我们将使用以下命令行来使用bowtie2对齐两个ChIP样本：

： $ Bowtie2 -x Synechocystis -U N_ChIP.fq -S N_ChIP.sam
： Bo wtie2 -x Synechocystis -U N_Input.fq -S N_Input.sam
SAM到BAM。为了分析我们的对齐读取，我们需要转换从Bowtie2获得的SAM文件的格式，以更高效地使用对齐的读取。 SAM格式文件是非常大的文件，必须转换为二进制对齐映射（.BAM）格式。 BAM文件是包含相同信息的SAM文件的二进制编码版本，但通常较小。它被大多数程序接受，一旦它被排序和索引，就分析对齐数据。
为了将SAM格式转换成BAM格式，我们使用Samtools。
在Samtools中将SAM文件转换为分类的BAM文件的通用命令行为：

：$ samtools view -bS alignment_file.sam＆gt; alignment_file.bam
：$ samtools sort alignment_file.bam＆gt; alignment_file_sorted
：$ samtools index alignment_file_sorted.bam
参数：
- alignment_file.sam：由bowtie2生成的对齐SAM文件的名称。
- alignment_file.bam：生成的BAM文件的名称。
- alignment_file_sorted：生成的最终排序后的BAM文件的名称。

因此，命令行将 N_ChIP.sam 和 N_Input.sam 转换为 N_ChIP_sorted.bam 和 N_Input_sorted.bam ，分别是：

SAM到BAM的转换：
：$ samtools view -bS N_Input.sam＆gt; N_Input.bam
：$ samtools view -bS N_ChIP.sam＆gt; N_ChIP.bam

排序BAM文件：

：$ samtools sort N_Input.bam＆gt; N_Input_sorted.bam
：$ samtools sort N_ChIP.bam＆gt; N_ChIP_sorted.bam

最后，索引文件是使用 samtools index 生成的：

：$ samtools index N_Input_sorted.bam
：$ samtools index N_ChIP_sorted.bam

注意：Samtools索引会生成.bai文件，这些文件必须与排序后的bam文件放在同一个文件夹中。否则，像Bamcoverage或IGV这样的程序将不会加载排序后的bam文件。
BAM文件标准化。 BAM文件仍然是大文件，使用IGV等基因组浏览器检查这些文件需要在个人计算机上使用高内存。为了解决这个问题，我们使用了Deeptools2（v2.0）套件中的Bamcoverage实用程序。该工具将读取或片段对齐为输入（BAM文件）并生成覆盖轨道（bigwig或bedGraph）作为输出。 bigwig文件比BAM文件小，便于在IGV中同时加载多个ChIP-seq轨道（图4）。此外，Bamcoverage将所有ChIP-seq文件（使用不同的方法，即，读取Per Kilobase per Million映射读数; RPKM）对所有ChIP-seq文件进行归一化处理，以比较具有不同测序深度>即，读取次数不同）。 Bamcoverage生成的大规格文件可以加载到IGV中检查和分析NtcA结合峰（图4）。 IGV需要以特殊格式文件加载基因组。对于本教程，可以在GitHub网站上找到IGV格式的 Synechocystis 基因组文件（pcc6803.genome.fasta和pcc6803.genome.fasta.fai）。请参阅IGV网页上的用户指南，了解如何为IGV创建基因组文件。

图4.使用Integrated Genomics Viewer生成的NtcA ChIP-seq数据可视化两个IP样本（NH + 4 + sup和-N）及其它各个输入采样由四个独立的轨道表示。每条轨道的y轴表示测序DNA片段的标准化覆盖率。 A. NtcA ChIP-seq的全基因组覆盖。 B.位于用于-N处理的glnA启动子区域内的NtcA峰周围的变焦染色体区域，其对于NH 4 4 +处理不存在，和两个输入样本。

一个Bamcoverage用法的例子：

：$ bamCoverage -b alignment_file.bam -o coverage_file.bw
-normalizeUsing

- b alignment_file.bam ：文件来处理（排序）
- o coverage_file.bw ：输出文件格式为大写。
- normalizeUsing ：使用四种不同的方法规范每个bin的读取次数：CPM =每百万次mapper读数，BPM =每百万次映射读取次数，RPGC =每个基因组内容的读取次数，以及RPKM。

使用RPKM方法规范化ChIP-seq数据的命令行如下：

：$ bamCoverage -b N_Input_sorted.bam -o N_Input.bw
-normalizeUsingRPKM
：$ bamCoverage -b N_ChIP_sorted.bam -o N_ChIP.bw
-normalizeUsingRPKM
呼叫高峰。呼叫峰值使用两个程序进行，MACS和Bioconductor R软件包BayesPeak。这两个程序都没有输入DNA的序列文件，使用来自IP的区域计数作为背景。当输入DNA样本可用时，他们将IP与输入样本进行比较以确定富集。与单独使用IP样本相比，该程序导致更好的灵敏度和特异性。对于这两个程序，先前从IP和输入库生成的BAM文件都用作输入文件。 MACS是一种非常流行的峰值搜索器，可以在Linux或MAC计算机上使用命令行界面运行。在这里，我们使用命令行显示一个标准的MACS分析。要使用BayesPeak软件包，请参阅Bioconductor网页上提供的用户信息（ https ：//bioconductor.org/packages/release/bioc/html/BayesPeak.html ）。

一个使用MACS进行呼叫峰值的例子：

：$ macs14 -t ChIP_alignment_file.bam -c Input_alignment_file.bam
-g genome_size -n outputfile_name --bw --nomodel --shiftsize

参数：
- t ChIP_alignment_file.bam： ChIP-seq处理BAM文件
- c Input_alignment_file.bam：控制或输入BAM文件
- g genome_size：序列生物体的基因组大小
- n outputfile_name：分析过程中生成的任何MACS文件的名称
- bw：用于扫描基因组进行模型构建的带宽。该参数可以设置为预期的超声处理片段大小（见步骤B4）
- nomodel：此设置是可选的。它跳过模型构建步骤。当将MACS应用于具有宽峰的ChIP-seq数据时，建议使用这种方法。
- shiftingize：转换大小以bp为单位。

用MACS分析我们的ChIP-seq数据的命令行如下：

：$ macs14 -t N_ChIP_sorted.bam -c N_Input_sorted.bam
-g 3.5e6 -n NtcA_N --bw 200 --nomodel --shiftize 50

MACS将生成四个文件，包括NtcA_N_peaks.xls文件。该文件包含Excel格式的表格，其包含关于检测到的峰值的信息，包括染色体名称，峰的起始位置，峰的末端位置，峰区的长度，与峰区的起始位置相关的峰顶位置，峰值区域，峰值区域的-10×log 10（ P 值），针对具有局部lambda的随机泊松分布折叠富集该区域，以及错误发现率（FDR）百分比。在我们的例子中，共检测到95个结合峰。 MACS生成的其他三个文件为：NtcA_N_peaks.bed（包含峰值位置的BED格式文件），NtcA_N_summits.bed（包含峰峰位置的BED格式文件）和NtcA_N_negative_peaks.xls（包含负值信息的表格文件峰）。通过交换ChIP-seq和控制通道调用负峰。在我们的案例研究中，调用了零负峰值。有关可用于MACS的所有设置选项的详细说明，请参阅 https：// github .com / taoliu / MACS / blob / macs_v1 / README.rst ）。
峰值注释。为了检索MACS获得的结合峰附近最近的基因并注释每个峰的基因组区域，我们使用了Bioconductor R软件包ChIPseeker。它支持ChIP峰的注释，并提供可视化ChIP峰覆盖率的工具以及与转录起始位点（TSS）区域结合的峰分布图。要使用ChIPseeker，必须安装Bioconductor软件包GenomicFeatures，它使用TxDb对象存储转录本元数据。这些对象包括与基因组相关的一组mRNA或DNA序列的5'和3'非翻译区（UTR）和蛋白质编码序列（CDS）的图谱。在这里，我们将基于Synechocystis GTF（通用特征格式，每个特征包含一行，每个包含九列数据以及可选的轨道定义行）创建一个TxDb对象。这个基因组功能文件可以在GitHub教程页面上找到。

在R中执行以下命令以使用GenomicFeatures创建基因组特征文件：

＃安装GenomicFeatures和ChIPseeker
source（“https://bioconductor.org/biocLite.R”）
biocLite（“GenomicFeatures”）
biocLite（“ChIPseeker”）

＃使用GenomicFeatures中的makeTranscriptDbFromGFF函数创建TxDb
library（GenomicFeatures）
setwd（指向计算机中教程文件的路径）
txdb＆lt; - makeTxDbFromGFF（'NC_000911.1.gff'，format ='gff'）
基因＆lt; - 基因（txdb）

现在，我们可以使用ChIPseeker中的annotatePeak函数对峰进行注释。我们将在峰呼叫分析中使用由MACS生成的BED文件（参见上文）。函数annotatePeak需要一个包含峰的对象（床格式的峰），一个TSS范围区域（在我们的例子中：距离TSS约-300 bp和+300 bp）以及上面创建的Synechocystis TxDb对象。
注释峰的命令行如下：

＃使用ChIPseeker进行峰值标注。
图书馆（ChIPseeker）
peakfile ='NtcA_N_peaks.bed'由MACS生成并位于与R工作目录相同的目录中的#bed文件
peakAnno＆lt; - annotatePeak（peakfile，tssRegion = c（-300,300），TxDb = txdb）
write.table（peakAnno，file ='N_annotated_peaks.txt'，sep ='\ t'）
来自ChIPseeker的输出文件包含位置，链，以及从最近基因的峰到TSS的距离。在注释栏（启动子，5'UTR，3'UTR，外显子，内含子，下游，基因间）中也报道了峰的基因组区域。

笔记

本文中提到的所有软件都可以在装有Linux（Ubuntu 14或更高版本）或Mac OS（Mac OSX 10.6或更高版本）的计算机上轻松安装和运行。它们需要至少2 GB的RAM和2 GHz的双核处理器才能处理大小为3.6×106的基因组（如）。要存储分析过程中生成的所有文件，根据实验样本的数量，至少需要25-50 GB的硬盘空间。但是，要执行我们的数据分析部分中介绍的教程，只需要1 GB的硬盘空间。大多数软件也可以在Windows中执行，但需要更长的安装过程。或者，上面列出的一些生物信息工具由在线平台提供，例如Galaxy（ https://usegalaxy.org/）。

食谱

5倍TBS缓冲液（1升）
100毫升1M Tris-HCl（pH 7.5）
150毫升5M NaCl
ddH 2 O到1L
过滤无菌
在4°C储存
1x裂解液（100 ml）
10ml 0.5M HEPES / KOH（pH7.5）（最终50mM）

28毫升5 M NaCl（终浓度140毫摩尔） 200μl0.5M EDTA（1mM终浓度）
5毫升20％Triton X-100（1％最终）
2毫升5％脱氧胆酸钠（终浓度0.1％）
无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒
MilliQ H 2 O至100毫升
过滤消毒
在4°C储存
块溶液（20毫升）
20毫升1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）
0.1克牛血清白蛋白（BSA）
始终使用新的解决方案
1次清洗缓冲液1（100毫升）
10ml 0.5M HEPES / KOH（pH7.5）（最终50mM）
10毫升5M NaCl（终浓度500毫摩尔）
200μl0.5M EDTA（1mM终浓度）
5毫升20％Triton X-100（1％最终）
2毫升5％脱氧胆酸钠（终浓度0.1％）
无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒
MilliQ H 2 O至100毫升
过滤消毒
在4°C储存
1倍清洗缓冲液2（100毫升）
2.5ml 1M Tris-HCl（pH 8）（终浓度10mM）

2.5毫升10毫升LiCl（最终250毫米） 5毫升10％NP-40（最终0.5％）
10毫升5％脱氧胆酸钠（终浓度0.5％）
MilliQ H 2 O至100毫升
过滤消毒
在4°C储存
5倍IP洗脱液（2毫升）
500μl1M Tris-HCl（pH 7.5）（终浓度250 mM）
200μl0.5M EDTA（最终50mM）
1毫升10％SDS（最终5％）
MilliQ H 2 O 2至2ml
TE + NaCl溶液（25毫升）
250μl1M Tris-HCl（pH7.5）（终浓度10mM）
50μl0.5M EDTA（终浓度1mM）
2.5毫升5M NaCl（最终50毫米）
蛋白酶K溶液（1毫升）
20 mg蛋白酶K（终浓度20μg/μl）
20μl1M Tris-HCl，pH7.4（终浓度20mM）
1μl1M CaCl2（最终1M）
625μl80％甘油（50％最终）
在-20°C储存
只能稳定6个月
痕量金属混合物A5（1L）
2.86克H 3 BO 3 3 0.22克ZnSO 4·7H 2 O 1.81克MnCl 2·4H 2 O
0.31克Na 2 MoO 4·2H 2 O
0.08克CuSO 4·5H 2 O
0.05克Co（NO 3）2：0.6H 2 O
100x BG11（1 L）
7.5克MgSO 4·7H 2 O
3.6克CaCl 2·2H 2 O 0 0.6克柠檬酸
0.6克Fe-NH 4柠檬酸盐
0.1克Na 2 -EDTA
2.0克Na 2 CO 3 3/2 100毫升痕量金属混合物A5
ddH 2 O到1L
BG11 0 C（1L）
1克NaHCO 3
0.2ml 1M K 2 HPO 4 4 10毫升100x BG11
ddH 2 O到1L
使用前高压灭菌器
BG11 0C-NH4（1L）
970 ml高压灭菌的BG11 0 C C 10ml预过滤的1M NH 4 Cl（10mM终浓度）
20 ml预过滤的1M TES pH 7.5（20 mM终浓度）

致谢

该协议改编自Picossi 等人（2014）。衷心感谢Trudi A. Semeniuk对本协议的认真校对。这项工作得到了国家葡萄牙基金通过FCT项目[PTDC / BIA-MIC / 4418/2012，IF / 00881/2013，UID / BIM / 04773/2013-CBMR，UID /多/ 04326/2013-CCMAR]。 MAHP目前的职位由澳大利亚政府通过澳大利亚研究委员会翻译光合作用卓越中心（CE1401000015）资助。 JGL目前的职位分别由西班牙经济和经济部和欧洲区域发展基金（FEDER）BIO2016-77639-P（MINECO / FEDER）资助。没有任何作者有任何利益冲突或竞争利益需要申报。

参考

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