材料和试剂

P1000，P200，P20移液器吸头（任何供应商）
15和50毫升锥形管（任何供应商）
PrimeFlow RNA管（Thermo Fisher Scientific，目录号：19197）
PrimeFlow RNA 96孔板（Thermo Fisher Scientific，目录号：44-17005）＆nbsp;
PrimeFlow RNA洗涤缓冲液（Thermo Fisher Scientific，目录号：00-19180）
Fixable Viability染料eFluor TM 506（Thermo Fisher Scientific，eBioscience TM，目录号：65-0866-14）
PrimeFlow RNA固定缓冲液1A（Thermo Fisher Scientific，目录号：00-18100）
PrimeFlow RNA固定缓冲液1B（Thermo Fisher Scientific，目录号：00-18200）
PrimeFlow RNA固定缓冲液2（8x）（Thermo Fisher Scientific，目录号：00-18400）
PrimeFlow RNA通透缓冲液（10x）（Thermo Fisher Scientific，目录号：00-18300）
PrimeFlow®RNA酶抑制剂（100x）（Thermo Fisher Scientific，目录号：00-16002）
PrimeFlow RNA靶标探针稀释液（Thermo Fisher Scientific，目录号：00-19185）
PrimeFlow®RNA标记探针稀释剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：00-19183）
PrimeFlow ®补偿套件（Thermo Fisher Scientific，产品目录号：88-17001）
PrimeFlow RNA存储缓冲液（Thermo Fisher Scientific，目录号：00-19178）
AlexaFluor 647 IRF4（Thermo Fisher Scientific，PF-204，assay ID：VA1-13919-PF）和AlexaFluor 488 MAFB（Thermo Fisher Scientific，PF-204，assay ID：VA4-16783-PF）
PBS（Eurobio，目录参考：CS1PBS01-01）
EDTA（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM，目录号：15575020）
人血清（BioWest，目录号：S4190-190）
RPMI-Glutamax培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：61870010）
青霉素和链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15140122）
胎牛血清（Biosera，目录号：FB-1001）
M-CSF（Miltenyi Biotec，目录号：130-096-492）
IL-4（Miltenyi Biotec，目录号：130-093-922）
TNFa（Miltenyi Biotec，目录号：130-094-014）
FICZ（恩佐生命科学公司，产品目录号：BML-GR206-0100）
流式细胞仪缓冲液（见食谱）
单核细胞分化培养基（见食谱）

设备

P1000，P200，P20移液器
孵化器＆nbsp;
冰箱
冷冻机
金属加热块（如果使用1.5毫升管）
用于Eppendorf管的冷冻离心机（Eppendorf，型号：5424R）或平板（Eppendorf，型号：5810R）
具有3个激光（488nm，561nm，633nm）的流式细胞仪

软件

FlowJo V10（树星）

程序

注意：

该协议是根据PrimeFlow RNA Assay试剂盒（赛默飞世尔科技）的方案改编的。
最多可同时使用4个不同的目标探针。
Thermo Fisher Scientific提供4种探针类型：
类型1：Alexa Fluor 647
类型4：Alexa Fluor 488
6型：Alexa Fluor 750
类型7：Alexa Fluor 568
在我们的协议中，我们使用了Type 1 IRF4和Type 4 MAFB。
我们建议使用赛默飞世尔科技提供的96孔V型底板来更简单快速的操作。倒转平板弃去上清液。但是，也可以使用其他板或管。（详情请参阅'注意事项'）
对于该方案，我们使用从保存在冰上（基线）的新鲜血液纯化的人类CD14 +单核细胞，或者在含有100ng / ml M-CSF或100ng / ml M-CSF，5ng / ml IL-4,5ng / ml的TNFα和62nM的FICZ 3或12小时（Goudot等，2017）。

第1天：从细胞收获到细胞固定
1. 预热PrimeFlow RNA洗涤缓冲液至室温。
2. 将培养箱预热至40°C。您需要在使用之前24小时打开培养箱，以确保温度稳定。
3. 每个孔分配1.5×10 6个细胞。
4. 用50μleFluor TM 506固定存活染料（在流式细胞术缓冲液中1/250稀释）染色细胞20分钟。
5. 450×g离心5分钟，弃去上清液。
6. 加入200μl流式细胞仪缓冲液到每个样品并通过移液重悬细胞。
7. 450×g离心5分钟，弃去上清液。
8. 通过混合等量的PrimeFlow RNA缓冲液1A和PrimeFlow RNA缓冲液1B来制备固定缓冲液1。
9. 向每个样品分配200μl固定缓冲液1并通过移液混合。在2-8°C孵育30分钟。
10. 在4℃下1000×g离心4分钟并丢弃上清液。
11. 准备1x PrimeFlow RNA渗透缓冲液。用无RNase的水稀释10倍PrimeFlow RNA缓冲液至1倍，并以1/100稀释度添加RNase抑制剂。
12. 分配200微升Permeabilization缓冲区1到每个样品，并通过移液混合。不需要孵化。在4℃下以1000gxg离心4分钟。丢弃上清。
13. 重复步骤A11。
14. 准备1x固定缓冲液2.在PrimeFlow RNA洗涤缓冲液中稀释8x PrimeFlow RNA固定缓冲液2。
  混合。
15. 向每个样品分配200μl固定缓冲液2并通过移液混合。在室温下避光孵育60分钟。
16. 在室温下1000×g离心4分钟并弃去上清液。
17. 向每个样品中加入200μlPrimeFlow RNA洗涤缓冲液并通过移液重悬细胞。
  在4℃下1000×g离心4分钟并丢弃上清液。
18. 重复步骤A16。
19. 将细胞储存在100μlPrimeFlow RNA洗涤缓冲液中，RNase抑制剂在4°C黑暗中以1/100稀释过夜。
第2天：目标探针杂交
注意：对于以下步骤，为确保各孔之间的重复性，每次洗涤后剩余体积保持低于10μl非常重要。杂交步骤（步骤B）的体积必须为200μl。
1. 解冻20倍目标探头在室温下放置。
2. 预温的Prime Flow RNA在室温下将探针稀释液的目标温度控制在40°C，并使用PrimeFlow RNA Wash Buffer。
  每个样品需要100μlPrime Flow RNA Target探针稀释液
3. 在PrimeFlow Target Probe稀释液中稀释目标探针1/20。
  混合。
4. 将100μl稀释的靶标探针分配到每个样品（100μl细胞）并通过移液混合。在40°C黑暗的环境下，盖上培养皿2.5小时。
5. 在室温下1000×g离心4分钟。丢弃上清。
6. 向每个样品中加入200μlPrimeFlow RNA洗涤缓冲液并通过移液重悬细胞。
  在4℃下1000×g离心4分钟并丢弃上清液。
7. 重复步骤B6。
8. 向每个样品中加入100μlPrimeFlow RNA洗涤缓冲液并通过移液重悬细胞。
第2天：信号放大
注意：对于以下步骤，为确保各孔之间的重复性，每次洗涤后剩余体积保持低于10μl非常重要。所有杂交步骤的体积必须为200μl。
1. 预热PrimeFlow RNA预混合混合物，PrimeFlow RNA Amp混合物和PrimeFlow标记探针RNA稀释液至40°C。
2. 向每个样品分配100μlPrimeFlow RNA前级混合物，并通过移液混合。
  在40°C的黑暗中孵育1.5小时
3. 在室温下1000×g离心4分钟。弃上清。
4. 向每个样品中加入200μlPrimeFlow RNA洗涤缓冲液并通过移液重悬细胞。
  在4℃下1000×g离心4分钟并丢弃上清液。
5. 重复步骤C4。
6. 向每个样品分配100μlPrimeFlow RNA洗涤缓冲液。然后将100μlPrimeFlow RNA Amp Mix分配到每个样品并通过移液混合。
  在40°C的黑暗中孵育1.5小时
7. 在黑暗中解冻PrimeFlow RNA标签探针（100x）。
8. 在室温下1000×g离心4分钟。弃上清。
9. 向每个样品中加入200μlPrimeFlow RNA洗涤缓冲液并通过移液重悬细胞。在4℃下1000×g离心4分钟并弃去上清液。
10. 重复步骤C9。
11. 在PrimeFlow RNA标签探针稀释液中稀释100x PrimeFlow RNA标签探针。
12. 向每个样品分配100μlPrimeFlow RNA洗涤缓冲液。然后分配100μl稀释的PrimeFlow RNA标签探针到每个样品。通过移液混合。在40°C的黑暗中孵育1小时。 PrimeFlow RNA Label探针的最终浓度是0.5x。
13. 在室温下1000×g离心4分钟。弃上清。
14. 向每个样品中加入200μlPrimeFlow RNA洗涤缓冲液并通过移液重悬细胞。
  在4℃下1000×g离心4分钟并丢弃上清液。
15. 重复步骤C14。
16. 分配200μl流式细胞仪缓冲液到每个样品。在室温下1000×g离心4分钟。弃去上清液，并将细胞重悬于100μl流式细胞仪缓冲液中。
第2天：数据采集
1. 使用PrimeFlow ®补偿套件为AF488和AF647准备单色补偿管。您还应该为可固定染料和您使用的每种荧光抗体设置单一颜色控制。
  1. 标注两个管'AF488'和'AF647'。
  2. 通过涡流混合UltraComp eBeads微球。
  3. 添加一滴UltraComp eBeads到每个管。
  4. 将5μlAF488补偿控制和AF647补偿控制添加到相应的管中。通过轻弹来混合。
  5. 在4°C的黑暗中孵育30分钟
  6. 加入1 ml流式细胞仪染色缓冲液
  7. 在室温下500×g离心4分钟。
  8. 丢弃上清液，剩余量应保留100μl。
  9. 通过涡旋重悬残余体积。
2. 使用单色补偿管在细胞仪上设置PMT电压。
  每个单色管都有一个负的和一个正的微珠。
3. 获取每个单色补偿管。建议至少2,000次总事件能够正确计算补偿。
4. 采集每个样品管。建议至少有100,000个事件总数。

数据分析

数据分析使用FlowJo V10进行。使用单色管来计算补偿矩阵。将单核细胞仅与M-CSF（其驱动莫马克分化）或与M-CSF，IL-4，TNF-α和FICZ（其诱导单核细胞优先分化为mo-DC）的混合物一起培养。我们发现一部分单核细胞表达MAFB mRNA和其他IRF4 mRNA（图1）。没有单核细胞同时表达两种mRNA（图1）。 PrimeFlow RNA测定显示用M-CSF，IL-4，TNFα和FICZ培养3小时的单核细胞表达MAFB或IRF4并且它们的表达水平是相互排斥的（Goudot 等。，2017）。

图1.在3小时和12小时时MAFB +和IRF4 +单核细胞的比例。使用M-CSF或M-CSF，IL-4，TNFa和FICZ培养3小时或12小时后，将单核细胞直接进行PrimeFlow RNA分析。使用AlexaFluor488-MAFB和AlexaFluor647-IRF4探针。 A.门控策略。碎片和死亡细胞被封锁。 B. MAFB mRNA和IRF4 mRNA表达。

笔记

杂交过程中的温度是一个关键点。
在使用前至少24小时将培养箱预热至40°C，并确保温度保持稳定。
您可以用表面标记（步骤A6和A7之间）或细胞内标记（步骤A12和A13之间）对细胞进行染色。在最佳条件下（时间和抗体稀释）在黑暗中染色细胞。在1x PrimeFlow RNA渗透缓冲液中稀释抗体进行细胞内染色。＆nbsp;
该方案持续2天，细胞可以在4°C的PrimeFlow RNA洗涤缓冲液中过夜保存。但是，您可以跳过步骤A19并继续执行协议。您也可以在步骤B8之后停止。在这种情况下，在步骤B8中将稀释度为1/100的RNA酶抑制剂添加到PrimeFlow RNA洗涤缓冲液中，并将细胞在4℃避光保存过夜。
步骤A14可以在4℃在黑暗中过夜进行。在这种情况下，请在第2天执行步骤A15至B8并跳过步骤A18。
您可以购买Thermo Fisher Scientific所需的探针套件。如果没有您需要的商业探针，Thermo Fisher Scientific也可以设计定制的探针。
该协议是为96孔板设计的。但是，您也可以使用Thermo Fisher Scientific提供的1.5 ml离心管。对于40°C下的所有杂交步骤，将管放置在金属架上。从1.5毫升管中弃去上清液，吸出并不要破坏沉淀。剩余体积应为100μl。如果使用试管，请在步骤A8，A11和A14中使用1 ml而不是200μl缓冲液。在所有洗涤步骤中，使用1 ml PrimeFlow RNA洗涤缓冲液代替200μl。
传统聚苯乙烯96孔V型底板也可使用

食谱

流式细胞仪缓冲液
PBS（Eurobio）
2mM EDTA（Invitrogen）
0.5％人血清（您可以用1％胎牛血清或BSA代替人血清）
单核细胞分化的培养基
RPMI-Glutamax培养基（Gibco）
青霉素和链霉素
10％胎牛血清
100 ng /μlM-CSF
5 ng /μlIL-4
5 ng /μlTNFa
62 nM FICZ

致谢

这项工作得到了Agence Nationale de la Recherche（程序“Investissements d'Avenir”ANR-10-LABX-0043，ANR-10-IDEX-0001-02PSL和ANR-17-CE15-0011-01），INSERM和Bristol-Myers Squibb pour la Recherche en Immuno-Oncologie基金会。作者声明不存在利益冲突。

参考

Goudot，C.，Coillard，A.，Villani，AC，Gueguen，P.，Cros，A.，Sarkizova，S.，Tang-Huau，TL，Bohec，M.，Baulande，S.，Hacohen，N.， Amigorena，S.和Segura，E.（2017）。芳香烃受体控制单核细胞分化为树突状细胞与巨噬细胞免疫< 47（3）：582-596 e586。