材料和试剂

8张显微镜载玻片（ibidi，目录号：80826）
24孔组织培养板（Corning，Falcon ，目录号：353047）
无菌过滤吸头（0.5μl-1,000μl）（Corning，Axygen，目录号：TF-300-L-R-S，TF-20-L-R-S，TF-200-L-R-S和TF-1000-L-R-S）
10厘米培养皿（康宁公司，Falcon ，目录号：353003）
10 ml离心管（SARSTEDT，目录号：62.9924.284）
1.5 ml微量离心管（Sigma-Aldrich，目录号：EP0030120086）
1.2 ml Micro Titertube（Thermo Fisher Scientific，Quality Scientific Plastics，目录号：845-Q）
血清移液管，单独包装，10毫升（Corning，Falcon <®>，产品目录号：356551 ^{^{＆nbsp; ）}}
感兴趣的哺乳动物细胞系，在这里：小鼠胚胎成纤维细胞（见注1）
70％（v / v）乙醇（Chem Supply，目录号：EA043）
Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）或其他合适的完整生长培养基用于培养感兴趣的细胞系
胎牛血清（FBS）（Sigma-Aldrich，目录号：F9423）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（无菌）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：14190250）
青霉素/链霉素溶液（Sigma-Aldrich，目录号：P4333）
聚（I：C） - 荧光素（InvivoGen，目录号：tlrl-picf）
聚（I：C） - 罗丹明（InvivoGen，目录号：tlrl-picr）
dsRNA特异性单克隆抗体（J2，SCICONS英语和科学咨询，目录号：10010200）
RNA酶A（Sigma-Aldrich，目录号：R4875）
1x胰蛋白酶-EDTA溶液（Sigma-Aldrich，目录号：59430C）
多聚甲醛（PFA）粉末（Sigma-Aldrich，目录号：158127）
吐温20（Sigma-Aldrich，目录号：P1379）
DAPI（4'，6-二脒-2'-苯基吲哚二盐酸盐）粉末（Sigma-Aldrich，目录号：D9542）
Immersol TM浸渍油（Carl Zeiss，目录号：4449620000000）
完整的生长培养基（见食谱）
10％FBS / PBS（见食谱）
4％多聚甲醛（w / v）（见食谱）
渗透缓冲液（见食谱）
DAPI解决方案（请参阅食谱）

设备

移液助剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：9531）
0.5微升至1毫升微量移液管（梅特勒 - 托利多国际公司，Rainin，型号：Pipet-Lite TM XLS +）
血细胞计数器
二类生物安全柜/组织培养罩
加湿的CO 2培养箱（95％空气，5％CO 2，37℃）。
倒置光学显微镜（相衬）
37°C水浴
带玻璃巴斯德吸管的真空抽吸系统
台式离心机配有摆动式转子，用于10 ml锥形管
微量离心机
LSRFortessa X20（BD，BD Biosciences，型号：LSRFortessa TM X-20）或等效的流式细胞仪
LSM 780共聚焦激光扫描显微镜（ZEISS，型号：LSM 780）或等效显微镜

软件

FIJI / ImageJ
蔡司ZEN包
Microsoft Excel
FlowJo
GraphPad Prism 7

程序

细胞培养和维护
1. 在第二类生物安全柜/组织培养罩中进行所有细胞培养工作。
  使用70％（v / v）乙醇确保工作表面和材料消毒。
2. 使用10cm细胞培养皿或细胞培养瓶，在湿润的CO 2培养箱（95％空气，5％CO 2，37℃）中在完全生长培养基中培养选择的哺乳动物细胞C）。在这里，我们使用源自C57BL / 6小鼠的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）和缺乏dsRNA转运蛋白SIDT2的MEF作为我们感兴趣的基因（参见注释2）。
3. 使用标准细胞培养程序或供应商推荐的细胞维持细胞。在这里，大约每3-4天或在使用标准细胞培养程序使细胞达到100％融合前分裂MEFs（见注3）。
4. 刺激前一天，如上分裂细胞，并在光学显微镜下使用血细胞计数器或其他适当的方法测定细胞数量。
通过流式细胞术定量聚（I：C）摄取
1. 在总体积为500μl的完全生长培养基（根据需要可以接种细胞用于附加条件）下，在24孔板中一式三份地种植1×10 4个细胞用于以下条件：
  1. 未受刺激
  2. 用聚（I：C）刺激（见注4）
2. 让细胞粘附并在潮湿的CO 2培养箱（95％空气，5％CO 2，37℃）中静置过夜。
3. 第二天早上，从培养箱中取出细胞并向细胞培养基中加入1μg/ ml荧光素 - 聚（I：C）（参见注释5）。
4. 在37℃，5％CO 2下培养箱中培养24小时。
5. 刺激24小时后，使用真空抽吸系统，用玻璃巴斯德吸管小心地从每个孔中吸出完整的生长培养基。
6. 使用P1000移液管用1ml冷的1x PBS清洗细胞。
  小心地在孔的一侧添加PBS以避免细胞脱落。
7. 重复步骤B6共3次。
8. 通过向每个孔中加入500μl胰蛋白酶收获细胞，并在37℃，5％CO 2下孵育细胞5分钟。
9. 每孔加入500μl完全生长培养基
10. 通过上下移动3-5次轻轻地重悬细胞。
11. 将重新悬浮的细胞转移到新的1.5 ml微量离心管中。
12. 在500×g的微量离心机中离心细胞3分钟，并将沉淀重悬于500μl补充有10％FBS的PBS中。
13. 每孔加入10μlRNA酶A（5mg / ml储存液），终浓度为100μg/ ml（见注6）。
14. 在37℃和5％CO 2下培养细胞30分钟。
15. 在500×g的微量离心机中离心细胞3分钟。
16. 小心地吸取每口井的RNase A溶液。
17. 将细胞重悬于1 ml冷PBS中。
18. 重复步骤B15，共洗涤3-5次。
19. 将细胞重悬于200μl10％FBS / PBS中。
20. 将细胞转移到单独的1.2毫升Micro Titertube中，并放置在冰上。
21. 分析两种基因型细胞的掺入荧光并使用流式细胞术。比较荧光素 - 聚（I：C） - 刺激的细胞和未刺激的细胞（图1）之间的直方图和相应的平均荧光强度（MFI）。
  
  图1.通过流式细胞术分析聚（I：C） - 荧光素摄取 WT和 Sidt2 MEF的内吞活性通过在24小时刺激后测量荧光素 - 缀合的聚（I：C）的摄取来评估。 A.显示每个基因型的平均荧光强度（MFI）的代表性直方图。 B.聚（I：C） - 荧光素阳性细胞的平均百分比。 n = 3的技术重复和错误条代表±SEM。 SIDT2的丢失不影响聚（I：C）摄取。
聚（I：C）亚细胞定位的共聚焦分析
1. 在总体积为200μl的完全生长培养基（根据需要可以接种细胞用于附加条件）下，在8孔室中将5×10 3个细胞种植于以下条件下：
  1. 未受刺激
  2. 用聚（I：C）刺激
2. 第二天早上，从培养箱中取出细胞，并将1μg/ ml罗丹明 - 聚（I：C）加入到细胞培养基中（见注5）。
3. 在37°C，5％CO 2下孵育细胞24小时。
4. 用P200移液器小心吸出并丢弃每个孔中的完整生长培养基
5. 使用P1000移液器用200毫升冷的1x PBS清洗细胞。
6. 重复步骤C5，共3次洗涤。
7. 洗涤后，每孔加入200μl补充有10％FBS的PBS。
8. 每孔加入10μlRNA酶A（5mg / ml储存液），终浓度为100μg/ ml（见注6）。
9. 在37℃和5％CO 2下培养细胞30分钟。
10. 小心地吸取每口井的RNase A溶液。
11. 用200μl冷PBS洗细胞。
12. 重复步骤C11共3次。
13. 用200μl4％PFA在冰上固定细胞10分钟。
14. 用200μl冷PBS洗细胞。
15. 重复步骤C14共3次。
16. 用100 ng / ml DAPI溶液染色细胞，最终体积为200μl/孔，室温下10 min（见注7）。
17. 用200μl冷PBS洗细胞。
18. 重复步骤C17共3次。
19. 最后一次洗涤后，每孔加入200μlPBS。
20. 幻灯片现在可以进行成像，或者可以在4°C下保存2周。
21. 使用ZEISS LSM 780共聚焦显微镜（可使用等效显微镜）和25倍油浸物镜采集图像。
22. 从细胞的顶部到底部收集0.25μm切片的Z-Stack（图2A）。
23. 将图像保存为.lsm文件，并将每个条件分隔为单独的文件夹（例如，WT未处理，WT pIC处理，未处理，KO pIC处理）。
24. 拖放所有文件夹到一个文件夹中（见注8）。
25. 现在图像可以使用FIJI / ImageJ软件进行分析了（见下文）。

数据分析

确定图像的适当阈值
1. 在FIJI / ImageJ中打开包含具有代表性聚（I：C） - 罗丹明或替代dsRNA信号强度的细胞的图像文件。
2. 获取最大投影图像（导航到屏幕左上角的工具栏→图像→堆栈→Z项目→投影类型：最大强度→好）。
3. 通过调整最大投影图像窗口底部的C滑块，选择与poly（I：C） - 罗丹明对应的通道。
4. 从工具栏中选择图像→调整→阈值...
5. 将底部滑块设置为255.
6. 调整顶部滑块，直到阈值（红色）能够区分每个单独的点状内体（图2B）。在这里，我们使用了一个60的门槛。
7. 记下临界值。
  
  图2.通过共聚焦显微镜分析聚（I：C） - 罗丹明亚细胞定位A.WT和 Sidt2 - / -
亚细胞定位定量
1. 从 https://bitbucket.org/DrLachie/rna_subcell 下载FIJI宏文件。
2. 在FIJI / ImageJ中打开宏文件。
3. 将'GreenThreshold'更改为上面确定的阈值（，例如，'60'）。
4. 点击“运行”。
5. 打开输出\文件夹并检查细胞分割的准确性（图3A）和单个细胞逐点定量点的面积，强度和由宏确定的点数。
6. 使用Microsoft Excel打开位于顶层文件夹中的results.xls文件。
7. 在Prism GraphPad或同等软件（图3B）中计算并绘制平均点状面积，强度和点数的结果（见注9）。
  
  图3.使用FIJI / ImageJ宏定量聚（I：C） - 罗丹明亚细胞定位A.宏观定量后的代表性输出图像，显示使用DAPI描绘单个细胞之间的细胞分割。请注意poly（I：C）定位于细胞质而不是细胞核。 B.比较野生型和野生型之间平均斑点面积百分比，平均强度和平均斑点数目。数据绘制为平均值±SEM，并且在每个条件下分析至少5个代表性视野，每个包含5-22个细胞。 ** P ＆lt; 0.01，*** 0.001。

笔记

也可以使用其他感兴趣的贴壁细胞系，例如骨髓来源的巨噬细胞，HEK293T和NIH3T3等等。通过在1.5ml微量离心管中处理悬浮细胞并随后通过细胞离心涂片将固定细胞安装到显微镜载玻片上，我们还使用非贴壁细胞如DC2.4和骨髓衍生的树突细胞。但是，我们发现这种方法会导致细胞形态的损失，因此建议尽可能使用贴壁细胞。
我们以前曾报道SIDT2的丢失导致dsRNA在核内体内积聚（Nguyen等人，2017）。在这里，与WT MEF相比，使用MEFs评估内体亚细胞定位。缺乏或过表达感兴趣基因的细胞可以根据需要用于代替 - / - MEFs。
在这里，我们使用水浴预热1x PBS，1x胰蛋白酶溶液并将生长培养基完全培养至37℃。使用巴斯德移液管通过真空抽吸将旧培养基从细胞培养皿中移出。随后用10ml 1x PBS洗涤细胞，然后加入3ml（每10cm培养皿）的胰蛋白酶溶液并在37℃孵育3-5分钟。将分离的细胞重悬于10ml / 10cm培养皿中，上下移液2-3次并转移至10ml离心管中。将细胞在台式离心机中500×g，5分钟在室温下沉淀并重新悬浮于10ml新鲜完全生长培养基中。为了细胞维持，将1ml细胞悬液加入到具有10ml完全生长培养基的新的10cm细胞培养皿中，并在湿润的CO 2培养箱（95％空气，5％CO > 2℃，37℃）。
在这里，罗丹明或荧光素共轭聚（I：C）（InvivoGen）用于刺激细胞，因为它是可商购的并且容易获得。根据需要也可以使用替代荧光标记的配体。我们还使用dsRNA特异性单克隆抗体（J2，英语和科学咨询）通过免疫荧光染色成功检测到病毒dsRNA。
聚（I：C）的浓度和刺激的长度应根据感兴趣的细胞系优化。我们发现MEFs不能有效地内化poly（I：C），因此需要24小时的刺激时间。然而，骨髓来源的树突状细胞和巨噬细胞需要更短的刺激时间（1到3小时）以获得足够的摄取。
用RNA酶处理细胞会降解任何表面结合的dsRNA，同时保留内化的dsRNA。在这里，我们使用能够在低盐浓度下裂解ssRNA和dsRNA的RNA酶A.或者，RNA酶III可用于特异性切割dsRNA。
在洗涤剂的存在下用DAPI染色细胞以使细胞膜透化并允许DAPI接近核DNA是很重要的。我们使用0.1％Tween来透化细胞;然而，可以使用替代的洗涤剂，例如皂苷或Triton-X。
用于图像分析的FIJI宏需要两层文件夹才能继续进行分析。
在这里，我们证明SIDT2的丢失导致poly（I：C）的内体积累，这与我们先前的发现（Nguyen et al。 2017）一致。在该研究中，我们还进行了各种内体标记--EEA-1（早期内体），RAB-7（晚期内体）和LAMP-1（溶酶体）的瞬时转染和免疫荧光染色 - 以精确确定聚（I：C）在 Sidt2 - / - 单元格内。

食谱

完整的生长培养基
Dulbecco的改良Eagle培养基补充：
10％胎牛血清
100U / ml青霉素
100μg/ ml链霉素
过滤消毒，在4°C储存
10％FBS / PBS
450毫升无菌磷酸盐缓冲盐水
50毫升胎牛血清
在4°C储存
4％多聚甲醛（w / v）
1. 将4克PFA粉末溶于90毫升PBS中并在搅拌下加热至65℃。如果PFA不溶解，加入1 M NaOH溶液直至溶液变澄清。
2. 带上100毫升PBS。冷却并过滤。分装并储存在-20°C。根据需要解冻等分试样并立即使用。
透化缓冲液
10毫升PBS
10μl吐温20
DAPI解决方案
1. 以1 mg / ml的终浓度将原液溶解在无菌dH 2 O中。
2. 在透化缓冲液中稀释原液至终浓度为1μg/ ml。立即使用

致谢

我们感谢Wicks和Masters实验室的成员WEHI进行了有益的讨论。该协议改编自Nguyen等人（2017）免疫 47（3）：498-509.e6。 DOI：10.1016 / j.immuni.2017.08.007。这项工作得到了澳大利亚NHMRC（ID 520574和1064591），澳大利亚皇家内科学院，孟席斯基金会，中国社会科学院基金会（SM13-4846和SM14- 5566）和瑞德家族信托基金会的支持。作者宣称没有利益冲突。

参考

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