材料和试剂

物料
1. 移液器吸头
2. 多孔板（细胞培养级）（Greiner Bio One International，目录号：662160）
3. 50 ml离心管（细胞培养级）（Greiner Bio One International，目录号：210261）
4. 10毫升一次性吸管（Greiner Bio One International，目录号：607160）
5. 细胞过滤器（100μm，Corning，目录号：352360; 70μm，Corning，目录号：352350）
6. 手术刀
7. miniMACS分离单元（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-102）
  注意：标记EC的磁性细胞分选使用包括两个磁体的miniMACS分离单元（Miltenyi Biotec，Bisley，Surrey，UK）进行。将标记的细胞与MACS磁山羊抗 - 大鼠IgG（H + L）（Miltenyi Biotec）MicroBeads和链霉抗生物素蛋白（Miltenyi Biotec）MicroBeads一起温育，然后使用高梯度磁力分离柱（MS > + 栏，Miltenyi Biotec）根据制造商的说明放置在分离单元上。
8. 高梯度磁力分离柱（MS + 柱）（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-201）
动物
小鼠（Balb / c，6周龄至英国查尔斯河至1年或内部养殖设施）
试剂
1. 冰
2. 异氟醚
3. 磷酸盐缓冲盐溶液（PBS，Gibco）
4. II型胶原酶（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：17101015）
5. EC媒体
6. DNaseI解决方案
7. 0.125％胰蛋白酶在0.2％EDTA（Life Technologies）中
8. Dako安装媒体（Dako）
9. 微珠和链霉亲和素（Miltenyi Biotec，目录号：130-048-101）
10. 抗体
  1. 生物素化的异凝集素B4（购自英国彼得伯勒的Vector Laboratories公司）
    注意：抗CD40 mAb 3/23（大鼠IgG2a）（Van Den Berg等，1996）是G.Klaus博士（英国伦敦国立医学研究院）的一份礼物。
  2. 大鼠IgG2a（克隆R35-95，BD，Pharmingen TM，目录号：553927）
  3. 仓鼠鸡蛋（BD，CompBead TM ，目录号：552845）
  4. 小鼠IgG1（TdT鸡尾酒对照，Harlan Sera-Lab，Oxon，UK，Thermo Fisher Scientific，目录号：31903）
    注意：上述单克隆抗体16b和16c在染色实验中用作同种型匹配的对照抗体：大鼠IgG2a（克隆R35-95）;仓鼠Igs。为了阻断Fc受体，使用小鼠IgG2a和小鼠IgG1（TdT鸡尾酒对照，Harlan Sera-Lab，Oxon，UK）。
  5. MACS磁山羊抗大鼠IgG（H + L）（Miltenyi Biotec，目录号：130-048-501）
  6. 大鼠IgG 2b抗小鼠CD16 / CD32单克隆抗体（BD，目录号：553141）
  7. 二抗偶联罗丹明红-X（Molecular Probes）
11. FACS
  注：以下抗体购自Pharmingen（La Jolla，CA）。
  1. CD31（PECAM-1，克隆MEC13.3，大鼠IgG2a，k）（BD，Pharmingen TM，目录号：550274）
  2. CD105（内皮糖蛋白，克隆MJ7 / 18，大鼠IgG2a）（BD，Pharmingen TM，目录号：550546）＆nbsp;
12. 免疫荧光染色
  PECAM-1（MEC 13.3）（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-18916）
13. Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM，Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：41966-052）
14. 谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25030）
15. 10,000U / ml青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15140122）
16. 丙酮酸钠（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：11360039）
17. HEPES（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15630056）
18. 1％非必需氨基酸（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：11140050）
19. 2-巯基乙醇（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：31350010）
20. 热灭活的胎牛血清（FCS; Globepharm，Esher，UK）
21. EC生长补充剂（Sigma-Aldrich，目录号：E0760）
22. 2％明胶（来自牛皮的B型，Sigma-Aldrich，目录号：G7765）涂布的组织培养瓶（Nunc，Life Technologies，Paisley，UK）
23. 工作介质（见食谱）

设备

移液器
无菌烧杯100-150毫升（在180°C灭菌）
层流工作台
镊子（在180°C灭菌）
剪刀（180°C灭菌）
摇床
水浴
离心机（Hettich Instruments，型号：UNIVERSAL 320 R）
固定角转子（海蒂诗仪器，目录号：1620A）
EPICS Profile Cytometer（Coulter Electronics，Luton，UK）
荧光显微镜（蔡司epi荧光显微镜）

程序

注意：对于所描述的EC纯化，需要不超过一至两只动物的组织（见图1的图）。

图1.通过免疫磁性分离从组织分离内皮细胞（EC）组织由不同的细胞类型和基质组分组成，并且通常，内皮含量占总组织质量的1-2％。将组织机械破碎并酶促消化以产生单细胞悬液。将内皮特异性抗体加入到单细胞悬液中以标记EC。通过使用磁珠将EC与其他组分分离，导致EC的高纯度群体。

根据当地的动物法规安乐死小鼠。我们使用过量的异氟醚，导致呼吸停止在一分钟内。
尽可能无菌操作使用高压灭菌器械清除小鼠器官，如心脏，肺和肝脏，并用PBS冲洗以除去血液。＆nbsp;
在培养皿中，使用无菌的交叉式解剖刀，将组织切成2mm 3块。
通过低速离心（210×g，1分钟）在PBS中洗涤两次。
在潮湿的培养箱中，将胶原酶（0.5 mg / ml）溶液中的切块组织在37°C孵育1小时。
注：我们使用Gibco II型胶原酶，因为与其他胶原酶制剂相比，它具有更高的梭菌蛋白酶活性，非常适合消化心脏，骨骼，甲状腺，软骨和肝脏组织。注：它是从溶组织梭菌中分离出来的，并且包装成冻干的非无菌粉末，用于研究细胞或组织分离和器官灌流。 Gibco II型胶原酶活性保证大于125单位/ mg。
随后，每10ml细胞悬液加入75μlDNA酶I溶液，并在连续搅拌下在37℃水浴中再孵育30分钟。
通过细胞过滤器消化组织消除未消化的块。
用补充有2.5％FCS的PBS冲洗细胞过滤器两次以收集剩余的细胞。
在0.25％胰蛋白酶（每100毫克组织含1毫升胰蛋白酶）中继续孵育10分钟以获得单细胞悬液。
在500μl补充有2.5％FCS的PBS中清洗一次
在4℃用鼠免疫球蛋白孵育30分钟以阻断Fc受体。
注意：小鼠BD Fc Block是纯化的大鼠IgG 2b抗小鼠CD16 / CD32单克隆抗体。 br />
用含2.5％FCS的冷PBS洗两次。
在4°C与大鼠抗小鼠CD31，大鼠抗小鼠CD105和生物素化异凝集素B4孵育45分钟。
在冷的500μlPBS中补充0.5％FCS并计数细胞两次。
重悬沉淀并与PBS 0.5％FCS（200μl/ L，2.5×10 7细胞），大鼠抗小鼠Ig（25μl/ L，2.5×10 7 / sup细胞）和链霉亲和素缀合的微珠（25μl/ L，2.5×10 7细胞）在4℃（总体积250μl）中孵育15分钟。同时，按照制造商的说明将色谱柱装载到分离单元上（每1-2.5 x 10 7个细胞使用一个色谱柱），并用500μlPBS 0.5％FCS清洗每个色谱柱。
用250μl细胞悬液加载每个色谱柱。磁性标记的细胞保留在柱中，而未标记的细胞通过。细胞悬液流过色谱柱后，用500μlPBS 0.5％FCS洗涤柱子两次。有关详细步骤，请参阅视频在制造商的网站上。＆nbsp;
从磁铁上卸载柱子，使用提供的柱塞，用PBS 0.5％FCS洗脱磁性保留的细胞。
洗涤洗脱的细胞并在200×g下离心5分钟。在EC培养基中重悬（10 5细胞/ ml），并在用明胶预涂的碟/盘（表1）中平板化。这些培养物的表型和形态在培养10-15代时保持稳定，并且在任何阶段都未观察到非内皮来源污染细胞的过度生长。你可以获得约80％的收益。
注意：用明胶包被P100培养皿，放入培养箱（37°C）中至少30分钟，用PBS清洗并晾干。

表1.传代播种密度和体积
在5％CO 2中过夜培养后，除去未贴壁细胞并用75μg/ ml EC生长补充剂代替培养基。
汇合时，将EC与胰蛋白酶-EDTA或细胞解离溶液分开并表征。
注意：为了保留EC生理和基因表达的特征，组织标本应该在切除后立即进行处理。
建议在仓储中准备好可用的等分工作解决方案。

数据分析

FACS分析
将EC用胰蛋白酶/ EDTA（Life Technologies）从培养瓶中分离，洗涤并重悬于含有1％FCS（Globepharm）的磷酸盐缓冲盐水溶液（PBS，Gibco）中。然后将细胞（10 6细胞/ ml）与指定的单克隆抗体在4℃温育30分钟。然后将细胞在含有1％FCS的冷PBS中洗涤两次，并在4℃用适当的FITC缀合的二抗继续孵育30分钟。再次洗涤两次后，使用EPICS Profile Cytometer（Coulter Electronics，Luton，UK）分析细胞。
免疫细胞化学
在3％牛血清白蛋白中稀释的一级抗体在4℃下过夜，然后与二级抗体缀合的罗丹明红-X（Molecular Probes）在室温下温育1小时。细胞核在室温下用3％牛血清白蛋白稀释的Hoechst 33258标记15分钟。使用Dako固定介质（Dako）固定所有细胞，并使用荧光显微镜（Zeiss epi荧光显微镜）捕获荧光图像。
结果
1. 原代培养的EC表面分子表达模式表达CD31，通过流式细胞术测定CD105。如所证实的，分离后，分离的EC在心脏和肺中显示CD31和CD105的高水平表达（图2）。此外，小鼠EC在几个簇内生长形成单层，并且在明亮的场错误复制图3A和3B下显示出十天后呈现纺锤形和鹅卵石样外观。我们使用染料排斥锥虫试验进一步研究了这些细胞的可用性，发现存活力仍然很高，在第二次传代后达到80％以上，如图3C和3D所示。图3E显示了第2天和第10天EC接种的细胞存活百分比的统计分析。
  
  图2.从鼠肺和心脏纯化的EC的表型鉴定来自鼠肺（第1代）的EC分离物用每张图中指示的表面分子特异性抗体染色。
  使用同种型匹配的不相关抗体作为对照
  
  图3.分离后原代鼠肺和心脏内皮细胞的明场图像A和B分离的ECs进行形态学第2天（A）和第7天（B）的光学显微镜分析。 C，D和E.台盼蓝计数显示80％的细胞在第2天和第10天存活。
2. 在该协议中，培养的细胞保留了体内ECs的形态和功能关键特征。我们也能够显示CD31的免疫荧光染色阳性细胞（图4）。
  
  图4.分离的内皮细胞（EC）的免疫荧光表征将细胞旋转到显微镜载玻片上并对指定的抗原进行免疫荧光染色。 PECAM-1（MEC 13.3）（绿色）与4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（蓝色）。
3. 原代培养的小鼠内皮细胞的显着应用
  该协议提供了一个很好的机会来研究靶向分子的内皮特异性活性。产生大量小鼠EC的能力使其在心血管研究中非常有用。这种方法还降低了成本，并通过植入内皮细胞提高了在小鼠模型中研究基于EC的疗法的潜力。
结论
在这里，我们遵循这个简单快捷的方法来生成主EC线。这可以用于血管研究的多个通道。
统计分析
如所示，结果表示为平均值±SD或SEM。使用学生的 t - 测试和方差分析。所有报告的P值都是双面的。
小于0.05的P 值被认为是显着的

食谱

EC介质
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM，Gibco BRL，Paisley，苏格兰）
2mM谷氨酰胺（Gibco）
100U / ml青霉素（Gibco）
100μg/ ml链霉素（Gibco）
1mM丙酮酸钠（Gibco）
20mM HEPES（Gibco）
1％非必需氨基酸（Gibco）
50mM 2-巯基乙醇（Gibco）
新鲜加入20％热灭活的胎牛血清（FCS; Globepharm，Esher，UK）

75μg/ ml EC生长补充剂（Sigma，Poole，UK）用2％明胶（来自牛皮的B型，Sigma）涂覆的组织培养瓶（Nunc，Life Technologies，Paisley，UK）制备

致谢

K.CP. Cheung和F.M.Marelli-Berg得到英国心脏基金会CH / 15/2/32064和Barts Charity授予MGU0377的资助。作者宣称没有利益冲突。

参考

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Cid，M.C。，Segarra，M.，Garcia-Martinez，A。和Hernandez-Rodriguez，J。（2004）。全身性血管炎发病机制中的内皮细胞，抗中性粒细胞胞质抗体和细胞因子 Curr Rheumatol Rep 6（3）：184-194。
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Van Den Berg，T. K.，Hasbold，J.，Renardel De Lavalette，C.，Dopp，E.A。，Dijkstra，C.D。和Klaus，G.G。（1996）。小鼠CD40的特性：树突状细胞和上皮细胞上CD40表位的差异表达。免疫学 88（2）：294-300。
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