材料和试剂

6孔板（不含DNA酶和RNase，处理）（Greiner Bio One International，目录号：657160）
低温瓶（Corning，目录号：430659）
2毫升血清移液管（VWR，目录号：76093-882）
1,000μl微量吸管（VWR，目录号：89079-974）
15毫升锥形管（VWR，目录号：490001-623）
微管吸头（VWR，目录号：490000-468）
细胞刮刀（康宁，目录号：3008）
带PES膜（0.22μm孔径）的无菌一次性过滤系统（Thermo Fisher Scientific，目录号：566-0020）
盖玻片（VWR，目录号：89015-725）
70％乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：459836）
Matrigel（BD，BD Biosciences，目录号：354234）
DMEM / F-12基础培养基（GE Healthcare，目录号：SH30023.02）
Essential 8培养基（Thermo Fisher Scientific，目录号：A2858301）
青霉素链霉素两性霉素B（Lonza，目录号：17-745E）
冻干的Y27632（Stemgent，目录号：04-0012）
1x不含钙和镁的Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（Thermo Fisher Scientific，目录号：14190144）
0.1％EDTA（在1：1000的DPBS中稀释1倍EDTA）（Corning，目录号：46-034-CI）
丙酮酸钠（Corning，目录号：25-000-Cl）
HEPES缓冲液（康宁，目录号：25-060-CI）
碳酸氢钠（康宁，目录号：25-035-CI）
非必需氨基酸（Corning，目录号：25-025-CI）
N1补充物（Sigma-Aldrich，目录号：N6530）
胎牛血清（FBS）（Atlanta Biologicals，目录号：S11150）
KnockOut TM血清替代品（KSR）（Thermo Fisher Scientific，目录号：10828028）
IWR1-endo（Stemgent，目录号：04-0010）
LDN 193189（Stemgent，目录号：04-0074）
胰岛素样生长因子1（IGF1）（R＆amp; D Systems，目录号：291-G1）
TrypLE Express解离试剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：12604021）
1x HBSS（Corning，目录号：21-022-CM）
二甲基亚砜（DMSO）（Fisher Scientific，目录号：BP231-1）
聚-D-赖氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：P6407）
4％多聚甲醛溶液（电子显微镜科学，目录号：157-4）
10％正常的驴血清封闭液（Jackson Immuno Research Laboratories，目录号：017-000-001）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
防褪色Fluoromount G固定介质（电子显微镜科学，目录号：17984-25）
4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，Enzo Life Scienes，目录号：ENZ-52404）
单克隆小鼠抗PAX6抗体（DHSB，目录号：PAX6）
多克隆山羊抗LHX2抗体（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-19344或sc-517243）
生物素化多克隆山羊抗人OTX2抗体（R＆amp; D Systems，目录号：BAF1979）
多克隆兔抗CRX抗体（GeneTex，目录号：GTX124188）
抗Recoverin抗体（EMD Millipore，目录号：AB5585）
冷冻培养基（NSC + 0.5％FBS培养基+ 10％DMSO）
Essential 8人类ESC / iPSC培养基（见食谱）＆nbsp;
岩石抑制剂Y-27632（10mM，1,000x，Stemgent，目录号：04-0012）（见食谱）
神经元干细胞培养基（NSC）（见食谱）
NSC + 0.5％FBS培养基（见食谱）＆nbsp;
ISLI + KSR视网膜诱导培养基（见食谱）

设备

垂直层流罩认证适用于生物材料的二级处理＆nbsp;
水浴
培养箱中的湿度和气体控制在空气中5％CO 2气氛中保持37°C和95％湿度
注意：孵化器需要能够根据步骤A4i的要求调整O 2 级别。 br />
低速离心机带有摆动式转子（，例如，Beckman Coulter，型号：GS-6），带有一个用于固定板的转接器
用适当的血清移液器移液助剂＆nbsp;
血细胞计数器＆nbsp;
带适当提示的微量移液器＆nbsp;
先生在室温下冷冻冷冻容器（Thermo Fisher Scientific，目录号：5100-0001）
-150°C冰箱或液氮（LN2）蒸气罐
-80°C冰柜＆nbsp;
-20°C冷冻机
冰箱（2-8°C）
倒置显微镜

程序

解冻并传代人ES和iPS细胞
1. 处理细胞之前进行灭菌
  使用前将生物安全柜暴露于紫外线灯下1小时，喷洒70％乙醇并擦拭橱柜内的工作区域，橱柜内使用的工具和耗材。
2. 制备Matrigel包被的平板
  1. 取1等分的冷冻基质胶（110μl）（BD Biosciences）并在冰上解冻。
    注意：Matrigel等分试样需要提前准备，并储存在-80°C冰箱中。
  2. 在12 ml冷冻（4°C）DMEM / F-12基础培养基（GE Healthcare）中溶解110μlMatrigel，上下移动以混合Matrigel和培养基。
  3. 向6孔板（Greiner Bio One，DNase和RNase free，处理）的每个孔中加入2ml Matrigel和培养基的混合物，并将板置于培养箱（37℃）中2-12小时然后将细胞接种到平板中。
3. Essential 8人ESC / iPSC培养基的制备（见配方1）
4. 解冻和播种细胞
  一般而言，准备6孔板中60％70％汇合处的1孔细胞冷冻成2个冷冻管。一瓶冷冻保存的细胞可成功回收到Matrigel涂层6孔板的1-2孔中。
  注意：根据冷冻保存多少个细胞聚集体，可能需要调整孔的数量。通常，解冻后每孔需要铺板两倍的细胞聚集体，以解释比常规传代期间更低的解冻后活力。
  1. 将标记Matrigel包被的平板，温热的Essential 8培养基（补充Rock抑制剂[配方2]）至室温（〜25°C），并在开始方案前制备所有其他细胞培养物，以确保解冻程序尽快完成。
  2. 在37℃水浴中快速融化细胞，轻轻摇动冷冻管，直到只剩下一小块冷冻细胞团。
  3. 除去水浴中的冷冻管并用70％乙醇擦拭。
  4. 使用2毫升血清移液管将冷冻管内容物转移到15毫升锥形管中。
    注意：使用2毫升血清移液器代替1毫升微量移液器可以最大限度地减少细胞聚集体的破损。
  5. 将5-7毫升温热的Essential8培养基（含有抑制剂）滴加到15毫升试管中，在加入培养基时轻轻混合。
  6. 在室温下将细胞在270×g离心3分钟。
  7. 吸出培养基，使细胞沉淀完好，用2毫升血清移液管轻轻地将细胞沉淀物重悬于1毫升Essential 8培养基（含有抑制剂）中，保持细胞为聚集体。
  8. 将0.5ml细胞混合物转移到含有岩石抑制剂必需品8的基质胶包被的6孔板的孔中（即，每个冷冻管可以铺两个孔）。
  9. 将培养板置于37℃缺氧培养箱（5％CO 2，5％O 2）中，移动培养板几个快速，短暂，背部和第四次和左右移动以均匀分布细胞聚集体。
    请勿打扰24小时注意：聚集体的不均匀分布可能导致人ES和iPS细胞的分化增加（图2）。
  10. 使用Essential 8培养基进行每日培养基更换，并视觉评估培养物以监测直到下一次传代时间的增长。检查解冻后约6-7天准备传代的未分化集落（密集居中）（图1和图2A）。
    注意：如果在解冻后只观察到少数未分化的菌落，则可能需要仅选择这些菌落进行传代，并在新涂布的平板上以相同大小重新铺平它们（即不分裂）。 />
  图1. Essential 8培养基中未分化的iPSC菌落（比例尺= 400μm）
5. 传递人类ES和iPS细胞
  在Essential 8培养基中维持的人ES和iPS细胞可以使用几种不同的方法进行传代。非酶促EDTA分解方法如下所述：＆nbsp;
  1. 用无菌工作区的显微镜下的1,000μl移液器吸头清除任何扁平或分化的细胞（图2B）。
  图2.培养物中未分化和分化的人ESC集落A.未分化的人ESC集落。 B.具有轮状外观的区分性人类ESC集落需要在继代培养之前清理。（比例尺= 400μm）
  1. 用2毫升DPBS冲洗细胞一次或两次。
  2. 在6孔板上每孔加入1ml 0.1％EDTA解离试剂，在室温下孵育3-5分钟。
  3. 在显微镜下检查分离迹象。
  4. 吸入EDTA解离试剂而不干扰细胞。
  5. 添加1毫升Essential 8培养基（含防石剂补充剂）。
  6. 使用细胞刮刀从孔底部提起细胞，用1,000微升移液管轻轻研磨，分解成含有20-40细胞的细胞团。
  7. 添加2毫升Essential 8培养基（添加了抑制剂）
  8. 将原始孔中的细胞添加到新孔中以达到20％的汇合。通常为汇合板的1：5比例。
    注意：如果细胞数量太少，细胞就不会生长;如果细胞太多，细胞生长过快，应该很快分裂。小块是理想的，如果细胞仍然是大块，用1,000μl移液管轻轻研磨大尺寸细胞聚集体几次，以分解它们。
  9. 将板放回到37℃的低氧培养箱（5％CO 2和5％O 2）中，并通过前后摇晃板和左右摇晃均匀分布细胞如上所述。
  10. 每天进行培养基更换，每孔2毫升Essential8培养基，目视评估培养物以监测生长，直到下一次传代时间。
诱导神经 - 视网膜的命运
1. 中等准备
  1. 神经元干细胞培养基（NSC）（500ml）的制备（参见配方3）。
  2. 制备含有0.5％FBS（100ml）的NSC培养基（参见配方4）。
  3. ISLI + KSR视网膜诱导培养基（50ml）的制备（参见配方5）。
2. 人类ES和iPS细胞中的视网膜诱导
  当孔中细胞达到60-70％汇合时，开始用ISLI + KSR视网膜诱导培养基处理细胞（每孔6孔板2ml），每日培养基更换5-6天。一旦细胞处于ISLI + KSR培养基中，在具有5％CO 2水平的常氧37℃培养箱中培养细胞。
  分化分化细胞的过程（第6-7天）
  1. 在分离前至少1小时更换2毫升新鲜ISLI + KSR视网膜诱导培养基
  2. 在分裂时，吸入介质。
  3. 向孔中加入1 ml TrypLE Express解离试剂;
    在室温下孵育6-8分钟，直到细胞彼此间松动接触
  4. 从孔底部轻轻刮去细胞并将细胞悬液转移到15ml离心管中。注意不要让单细胞悬液。
  5. 用2 ml 1x HBSS冲洗孔一次，以收集剩余细胞。
  6. 在270×g离心3分钟。
  7. 。轻轻吸出上清液，不会干扰细胞沉淀。
  8. 加入3-4毫升1×HBSS以重悬细胞沉淀，再以270×g离心3分钟。
  9. 。轻轻吸取1x HBSS，不要干扰细胞团。
  10. 在新鲜的ISLI + KSR视网膜诱导培养基中重悬细胞沉淀。分光比为1：3。
  11. 通过摇动平板并在含氧量正常的条件下返回培养箱，均匀地分配上述细胞。
  12. 第二天，通过查看附着在平板底部的细胞的百分比来检查细胞存活，死细胞不附着并漂浮在培养基中。如果细胞死亡太多，用2 ml 1x HBSS冲洗细胞一次或两次以清除死细胞。
  13. 通过在分裂后第1天加入1ml ISLI + KSR培养基和1ml NSC + 0.5％FBS培养基，将细胞逐渐加入补充有0.5％FBS的NSC培养基中;第2天0.5ml ILSI + KSR培养基+ 1.5ml NSC + 0.5％FBS培养基;从第3天开始，分化细胞将在NSC + 0.5％FBS培养基中培养以使它们进一步分化。当细胞达到汇合时，需要用TrypLE解离方法将细胞分裂成新的Matrigel包被的平板。这通常每7天进行一次，拆分比率为1：3至1：5，具体取决于细胞系。
    注意：如果细胞老化或受到压力，Rock Inhibitor可以添加到NSC培养基中，以帮助细胞在解离后存活。
神经视网膜玫瑰花结的分离（第18-21天）
分化细胞是由视网膜祖细胞群和视网膜色素上皮祖细胞（RPE）组成的混合群体（图3A），因为它们都来自相同的视泡囊。视网膜干/祖细胞形成簇（神经视网膜玫瑰花结），可以手动分离和扩展（图3B）。

图3.文化中差异化的早期视网膜玫瑰花结A.视网膜玫瑰花结在3周采摘和分选之前; B.采摘和重新接种后纯化的神经视网膜培养物。比例尺= 100μm。

手动分离视网膜干/祖细胞和视网膜色素上皮细胞的程序
1. 消毒台面以及显微镜上和周围的任何区域以及需要用70％乙醇直接接触细胞的工具。
2. 选择新的NSC + 0.5％FBS培养基
3. 在显微镜下，用无菌微量移液器尖端轻轻刮去密集的神经元细胞区域。如果太大，则刮去含有100-200个细胞簇的区域。
4. 在大部分神经元区域被解除后，收集含有浮动神经元玫瑰花结的介质。
5. 使用1,000μl移液管将它们转移至新的Matrigel包被的孔中，使细胞附着并在培养箱中的NSC培养基（37°C，5％CO 2）中生长。
视网膜干/祖细胞扩张
手动纯化的视网膜干/祖细胞需要在NSC + 0.5％FBS培养基中培养数月，以使细胞进一步分化以产生所有类型的分化的视网膜神经元（图4）。解离方法如下所述：
TrypLE解离法分化视网膜细胞
1. 吸引旧媒体。
2. 用1-2ml 1x HBSS（或DPBS）冲洗细胞一次或两次。
3. 吸取1x HBSS。
4. 向细胞中加入1ml TrypLE Express解离试剂，在室温下孵育6-8分钟，并在显微镜下检查解离的迹象（细胞 - 细胞连接松动并在密集细胞中出现空白空间）。不要等到细胞被提起（图4）。
  
  图4. TrypLE分化的视网膜分化细胞扩增。A.解离前视网膜细胞的形态学。 B.TripLE解离6分钟后视网膜细胞的形态学。比例尺= 400微米。
5. 使用细胞刮刀刮细胞。
6. 将细胞转移到15 ml离心管中。
7. 以270 x g旋转3分钟
8. 吸出上清液并加入2 ml 1x HBSS并重悬细胞。
9. 以270 x g旋转3分钟
10. 吸出上清液并加入NSC + 0.5％FBS培养基重悬细胞（每孔2ml），通常分离比例为1：3。
  注意：如果细胞出现压力，可以在步骤中添加岩石抑制剂以帮助细胞存活。
11. 在NSC + 0.5％FBS培养基中加入2ml细胞到孔中。
12. 将培养板放入培养箱（37°C，5％CO 2）中并左右摇晃，来回均匀分布细胞。
13. 细胞将在NSC + 0.5％FBS培养基中培养。
14. 根据需要每2-3天更换媒体。
在诱导视网膜分化1个月后，将种子细胞加到聚-D-赖氨酸（Sigma-Aldrich）和Matrigel包被的盖玻片上，然后进行免疫细胞化学分析以检查视网膜分化状态。在这个阶段，大多数细胞是视网膜祖细胞通过其视网膜干/祖细胞标志物PAX6和LHX2的表达。表征后，细胞可以冷冻保存。
视网膜干/祖细胞冷冻保存
冻结神经视网膜干细胞
1. 用1-2ml 1x HBSS冲洗细胞两次。
2. 每孔加入1 ml TrypLE于6孔板中孵育6-8分钟
3. 在此期间，开始用日期，细胞系，信息，等标记冷冻管。
4. 在步骤D4中检查显微镜下是否有分离迹象
5. 使用细胞刮刀刮细胞。
6. 将所有东西都转移到15毫升的管子里。
7. 旋转3分钟，270克x克
8. 处理上清液。
9. 加入2毫升1x HBSS并重新悬浮细胞。
10. 旋转3分钟，270克x克
11. 处理上清液。
12. 添加计算量的冷冻介质以重新悬浮细胞。
13. 加入1 ml细胞和冷冻培养基到每个冷冻管。
14. 立即将所有冷冻管放入冷冻室。
15. 将室转移到-80°C的冷冻箱中。
16. 第二天，取出小瓶，放入-80°C冷冻箱的适当盒子中。
17. 第二天将小瓶转移到液氮中。
解冻视网膜干/祖细胞
一瓶冷冻保存的视网膜干细胞/祖细胞可以成功地解冻成1孔的Matrigel包被的6孔板。＆nbsp;
1. 标记Matrigel包被的平板，将NSC + 0.5％FBS培养基（补充岩石抑制剂）温至室温（〜25°C），并在开始方案前制备所有其他细胞培养物，以确保解冻过程完成为尽可能迅速。
2. 在37℃水浴中快速融化细胞，轻轻摇动冷冻管，直到只剩下一小块冷冻细胞团。
3. 从水浴中取出冷冻管并用70％乙醇或异丙醇擦拭以消毒。
4. 使用1毫升微量移液管将冷冻管的内容物转移到15毫升的锥形管中。
5. 添加7毫升1x HBSS至15毫升试管中，轻轻混合，并加入培养基。
6. 在270×g离心3分钟。
7. 吸出上清液，并添加2毫升温暖的NSC培养基（由Rock Inhibitor提供）到15毫升管中以重悬细胞。
8. 将细胞混合物转移至Matrigel包被的6孔板的空孔中。
9. 将板置于37℃常氧培养箱（5％CO 2）中，以几个快速，短暂，前后和左右移动的方式移动板以分配细胞聚集体。
  请勿打扰24小时
10. 第二天更换媒体。如果发生过度的细胞死亡，请在培养基更换前用1x HBSS冲洗细胞。
11. 根据需要使用NSC培养基每2-3天进行一次培养基更换，并视觉评估培养物以监测直至下一次传代时间的生长。
在2和3个月诱导的视网膜分化后，将种子细胞加到聚-D-赖氨酸（Sigma-Aldrich）和Matrigel包被的盖玻片上，然后进行免疫细胞化学分析以检查光感受器分化状态（图5和6） >

图5.培养三个月后的融合神经视网膜培养（比例尺= 400μm）

图6.视网膜分化6周时由人iPSC产生的视网膜细胞的免疫细胞化学分析细胞表达视网膜干细胞标记物PAX6和LHX2以及光感受器标记物OTX2和RCVRN（比例尺= 10 μm）。
免疫细胞化学方案
1. 吸引旧的文化媒体
2. 。轻轻冲洗1次HBSS中的细胞2次，而不用提起细胞。
3. 在室温下将细胞固定在4％多聚甲醛溶液（电子显微镜科学）中30分钟。
4. 用1x PBS冲洗细胞3次，每次冲洗5分钟。
5. 在室温下封闭10％正常驴血清封闭溶液（Jackson Immuno Research Laboratories，封闭溶液通过在含有0.5％Triton X-100的1x PBS中稀释该溶液制备）1小时来封闭细胞。
6. 将具有预定浓度的初级抗体（表1）（在血清封闭溶液中制备）添加至细胞并在潮湿室中的冷室中孵育过夜。
  
  表1.用于视网膜分析的一级抗体
7. 第二天，用1x PBS冲洗掉未结合的一抗，每次冲洗3次，每次5分钟。
8. 加入第二抗体，并在室温下在潮湿的室内黑暗中孵育1小时。
9. 用1x PBS冲洗3次未结合的二抗，每次冲洗5分钟。
10. DAPI（工作浓度为0.5μg/ ml，用PBS制备）染色细胞核3-5分钟。
11. 使用防褪色Fluoromount G固定介质（电子显微镜科学）将盖玻片上的细胞安装到组织学幻灯片上。
注意：样品已准备好在具有荧光功能的显微镜上进行图像采集。

数据分析

分化的视网膜细胞的数据分析通过 t - 测试进行。从3-5个田地和至少3个独立实验计数表达给定抗体的总细胞以及田间总细胞（由DAPI标记）。将结果与未分化细胞或交替分化培养基中的标志物表达进行比较。通过该方案对人ES细胞和iPS细胞诱导的视网膜细胞分化的详细分析可以在最近公开的实验室开放获取论文（Zhu等人，2018）中找到。

笔记

虽然协议在我们实验室测试的多个细胞系中可靠工作。由于各种未分化细胞或衍生方法的不同培养条件，存在一些固有的变异性。作者还建议所有实验室使用商业试剂盒定期检测支原体污染的细胞系，因为它们会显着影响分化能力。

食谱

Essential 8人类ESC / iPSC培养基

对于新解冻的细胞，使用含有Rock抑制剂（Y-27632,10μM）的Essential8培养基以促进细胞存活。
Rock抑制剂（Y-27632）储备（10 mM，1,000x）
将2 mg冻干的Y27632（Stemgent）溶于625μl双蒸水中制成10 mM母液，并制成10μl等分试样并储存在-20°C冰箱中。
神经元干细胞培养基（NSC）（500毫升）
含0.5％FBS（100ml）的NSC培养基
ISLI + KSR视网膜诱导培养基（50毫升）
注意：在“ISLI + KSR”中，“I”代表IWR1，“S”代表SB431542，“L”代表LDN193189，最后的“I”代表IGF1，KSR代表KnockOut TM 血清替代品。

致谢

我们感谢曾宪民博士为人类iPS细胞系（NCL-1，NCL1-GFP）。人类ES系购自WiCell。这项工作得到了NEI基金EY025779，Buck学院基金的资助。该协议基于我们以前的工作（Zhu等人，2018年）。

参考

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Zhu，J.，Reynolds，J.，Garcia，T.，Cifuentes，H.，Chew，S.，Zeng，X。和Lamba，D.A。（2018）。从目前良好的生产实践中制造的可移植的视网膜光感受器 - 制造的人诱导多能干细胞系。 / a> 干细胞转移。