材料和试剂

50ml锥形管（如emning，Corning，目录号：430829）
0.2μm低蛋白结合过滤器（例如，Thermo Fisher Scientific，目录号：566-0020）
Slide-A-Lyzer透析盒（ThermoFisher），截留分子量≤10 kDa
塑料包装（例如，Saran包装）
玻璃血清移液器
胎牛血清（FBS）
二异丙醚（Sigma-Aldrich，目录号：296856）
正丁醇（Sigma-Aldrich，目录号：34867）
氯化钠（Sigma-Aldrich，目录号：793566）
蛋白质浓度测定法（例如，Bio-Rad蛋白质测定法，Bio-Rad Laboratories，目录号：5000006）
胆固醇测定法（例如，Sigma-Aldrich，目录号：MAK043）
甘油三酯测定法（例如，Thermo Fisher Scientific，目录号：TR22421）
组织培养基（例如，DMEM和RPMI）
4°C的盐水溶液（9 g / L氯化钠，154 mM）（见食谱）

设备

移液器
玻璃烧杯
玻璃量筒
分离漏斗（如果准备大量血清）
磁力搅拌盘
化学通风橱
生物安全柜（2级）
台式离心机（能够以4,000×g 旋转50ml锥形管）
氮气源（工业级）
能够测量适合于蛋白质测定的波长处的吸光度的分光光度计（例如，对于Bio-Rad蛋白质测定，595nm）。

程序

注：所有涉及开放管或含二异丙醚的瓶子的步骤应在化学通风橱中进行。

在4°C解冻胎牛血清（FBS）。我们已经执行了这个协议，血清量从50到500毫升不等。解冻两个等分试样：一个用于去脂和一个用作脂质补充对照。在4℃保存血清作为脂质补充对照，直到步骤8为止。在步骤2-7中完成脱脂。
在室温下在烧杯中的磁力搅拌板上搅拌融化的FBS，该烧杯能够容纳至少两倍所用FBS的体积。加入0.8体积二异丙基醚和0.2体积正丁醇并继续在室温下搅拌30分钟（例如，对于100ml血清，使用80ml二异丙基醚和20ml的正丁醇）。此时不应观察到分离的相（图1A和1B）。如果相分离，则增加搅拌速度（通常300-400rpm就足够了）。应使用玻璃量筒或玻璃血清移液器测量溶剂。
在4℃下以4,000×gg离心15分钟以分离各相。
在这一步骤中，混合物可以分装到50ml锥形管中（图1C）。

图1.胎牛血清（FBS）的初步脂质提取（步骤2-3）。 A.提取前的FBS。 B.将FBS与二异丙醚和正丁醇混合。混合速度应该足以防止相分离。 C.初次离心后，脂质处于上相和中间相，而血清蛋白保留在下层水相中。
使用玻璃吸管推动粘稠的上层相和中间层，并将下层相转移到新鲜的烧杯中。舍弃上层阶段。应该注意尽量减少上层相的数量，即使这会降低下层相的产量。
将下层相与一定体积的二异丙醚混合，该量等于所用血清的初始体积。在室温下在磁盘上搅拌30分钟。像以前一样，在混合过程中不应该看到单独的阶段。
如果使用少量的FBS，则像以前一样离心。用吸管取出上层相，收集下层相。如果使用更大量的FBS，将混合物转移到分液漏斗中，并使相分离（图2A和2B）。如果分液漏斗不可用，可将混合物分装到锥形管中并如上离心。使用分液漏斗完全去除上层相，或者如果离心，则通过移液并丢弃上层相（图2C）。

图2.在第二次有机萃取后使用分液漏斗除去血清蛋白（步骤6）。将步骤5中与二异丙基醚混合的A.FBS转移至分液漏斗中。 B.混合物静置后形成分离相。 C.将下层相移走并转移到新的烧杯中用于后续步骤。有机上层相保留在分液漏斗中，然后丢弃。
将较低相转移到新的烧杯中。以低速搅拌磁盘，同时让缓慢的氮气吹过血清表面。流速应该很低，以防止水分从血清中显着蒸发，同时允许挥发性有机物蒸发。在室温下混合2小时足以去除大部分污染溶剂。
在第9步中会纠正微量水分蒸发（会浓缩蛋白质）。
通过透析除去任何残留的溶剂污染物
1. 在冷盐水中预湿适当大小的透析盒，并将脂质剥离的（来自步骤7）和脂质补充（来自步骤1）血清转移至盒。
2. 在4℃下用4L盐水（9g / L氯化钠）透析过夜，在覆盖有保鲜膜的烧杯中轻轻搅拌混合物。
3. 第二天，将磁带转移到新的4L盐水中，然后重复。第三天透析生理盐水。在同一个烧杯中透析脂质去除的和脂质充足的血清是很重要的。如果透析总量超过400毫升，请使用较大量的生理盐水。
测量两种血清中蛋白质的浓度（例如，通过Bradford或BCA测定法）。可能需要稀释血清，以使蛋白质浓度处于所用测定方法的线性范围内。如果浓度不相等（由于体积减少，特别是在步骤7中），请用盐水稀释浓度更高的血清，以确保浓度相等。
在生物安全柜中通过0.2μm过滤器过滤血清来消毒血清
分装，并储存在-20°C。两种血清都可以代替正常的FBS用于标准细胞培养分析。

数据分析

可以使用各种方法来确认此方法的成功。我们通过与质谱（GC / MS）耦合的气相色谱法测量血清中单个脂质物质的丰度，以分析来自血清的Folch提取物（2：1氯仿：甲醇）的脂肪酸甲酯（FAME）衍生物（Hosios < 等。，2016）。多种商业酶促测定也可用于确定特定脂质类别的消耗。这些包括胆固醇或甘油三酯的测定。我们还证实，在用脂质去除血清培养的细胞中脂肪生成增加，这是脂质去除的预期反应（Hosios等人，2016年）。这可以通过将碳-14乙酸酯结合到Folch可提取的细胞材料中来测量。＆nbsp;
我们已经在含有10％（体积）透析的脱脂或富含脂质的血清的DMEM和RPMI培养基中培养多种细胞系（Hosios等人，2016年）。一些细胞系在两种血清中都类似地增殖，并且可以在无脂条件下维持几代，但其他细胞系用脂质去除血清增殖得更慢（图3）。为了确保观察到的增殖速率降低是脂质饥饿而不是不完全去除有机化学物质的结果，我们建议将单个脂质物质或脂质混合物返回至血清以证明细胞增殖的拯救。我们对与棕榈酸酯偶联的牛血清白蛋白（Oliveira et al。，2015）以及市售的脂质补充剂已取得成功。重要的是，血清含有大量的脂质物质，并且可以通过用不同的脂质物质补充脱脂血清来拯救单个细胞系的生长。我们还使用了一种水溶性胆固醇结合物来补充这种脂质对培养细胞的作用。

图3.含有脂质充足或脂质去除的FBS的培养基中细胞系的增殖率细胞在用PBS洗涤并暴露于实验培养基之前一天稀疏播种。在此时和四天后获得细胞计数，并将这些值用于通过拟合指数生长方程来计算细胞的增殖速率。每条代表n = 3次重复的平均值±标准偏差。

笔记

使用相同批次的血清产生透析的富含脂质的血清和透析的脂质消耗的血清。当需要比较具有和不具有脂质的条件时，所得批次血清用于实验中。理想情况下，同时产生的脂质耗竭和充足的血清应该用于比较两种情况的实验。＆nbsp;
二异丙醚易挥发，应在化学通风橱中使用。
我们倾向于将血清透析生理盐水而不是磷酸缓冲盐溶液，以避免血清添加到细胞培养基时显着增加磷酸盐的浓度。

食谱

冷盐水溶液
1. 通过将292.2g氯化钠溶解在700ml去离子水中制备5M氯化钠溶液。在磁力搅拌盘上混合时，可能需要加热溶液。用额外的水将容量调高至1升。该解决方案可以在室温下储存。
2. 将123.2ml 5M氯化钠与3876.8ml去离子水混合。在4°C下用塑料包裹的烧杯保存一天，待使用前冷却。

致谢

该协议已经由Thiele Lab在 LipidomicNet 上发布的协议进行了改编，作者感谢来自国家癌症研究所，Lustgarten基金会和站立对抗癌症基金会的支持MGVH得到了霍华德休斯医学研究所的一个教授学者奖的支持，我们也感谢Vander Heiden实验室的成员给予帮助讨论使用脱脂血清研究脂质代谢。
作者没有意识到在编写本协议时有任何利益冲突。

参考

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