材料和试剂

移液技巧（高压灭菌，任何品牌）
29号注射器（BD，目录号：328421）
40μm尼龙网格细胞过滤器（Corning，目录号：352340）
Minisart NML注射器过滤器，0.2μm（Sartorius，目录号：17597-K）
14毫米圆盖玻片（适用于细胞培养的任何品牌）
24孔板和100mm培养皿（Thermo Fisher Scientific，Nunc TM，目录号：142475和172931）。
15毫升锥形管（Corning，目录号：352196）
玻璃幻灯片（OMANO，目录号：OMSK-50PL）
细胞培养培养皿和多孔板（Thermo Fisher Science，目录号：174888,150350,142485）
1.5 ml Eppendorf管（Fisher Scientific，目录号：05-408-129）
小鼠4-7周龄（任何合格的供应商，小鼠品系/遗传背景应与其他测定一致）
α-MEM（Thermo Fisher Scientific，目录号：A1049001）
胎牛血清（Thermo Fisher Scientific，目录号：10099141）
重组鼠M-CSF（PeproTech，目录号：315-02）
重组小鼠RANKL（PeproTech，目录号：315-11）
红细胞裂解缓冲液（BD，目录号：555899）
白蛋白，牛血清，V级（Merck，目录号：12659）
酸性磷酸酶，白细胞（TRAP）试剂盒（Sigma-Aldrich，目录号：387A）
丙酮（Fisher Scientific，目录号：A18-1）
37％甲醛（Fisher Scientific，目录号：BP531-500）
中性香脂（Sangon Biotech，产品目录号：E675007）
氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，目录号：BP358）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P5405）
磷酸二氢钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S5136）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P5655）
盐酸（HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：H9892）
培养基（见食谱）
磷酸盐缓冲盐水（见食谱）
鼠rRANKL和rM-CSF溶液（见食谱）

设备

移液器（Eppendorf，70％乙醇消毒表面）
血细胞计数器（OMANO，目录号：OMSK-HEMA）
解剖镊子和剪刀（高压灭菌）
剪刀（Fisher Scientific，产品目录号：08-940）
镊子（Fisher Scientific，目录号：12-460-612）
制造商：Integra LifeSciences，Integra ^{® Miltex ^{® ，产品目录号：MH18782。
镊子（Fisher Scientific，目录号：12-460-611）
制造商：Integra LifeSciences，Integra ^{® Miltex ^{® ，产品目录号：MH18780。}}}}
细胞培养孵化器（任何品牌）
离心机（Thermo Fisher Scientific，型号：Hearus Labofuge 400 R）
平衡
倒置显微镜（尼康仪器，型号：Eclipse Ti-S）
水浴（任何品牌可以达到37°C）

程序

注意：对于协议中包含的动物实验，请参考您所在研究所的具体规定。在我们的研究中，所有的动物研究都是根据实验动物护理和使用指南进行的，并获得了机构生物医学研究伦理委员会的批准。

第0天：提取骨髓细胞
注意：程序中的介质或缓冲区的容量适用于一个鼠标。如果处理多个鼠标，请调整音量。
1. 牺牲4-7周龄的小鼠颈椎脱臼，并迅速用70％乙醇消毒身体表面。
2. 立即用剪刀在脚踝和大腿的上端切开鼠标的四肢。去除皮肤和肌肉以显示骨骼。用剪刀在膝盖处切断使股骨和胫骨脱位。
  用预先冷却的PBS冲洗骨骼两次以去除过多的肌肉组织（图1A）。
3. 去除每块骨头的两端（图1B），并用29号注射器冲洗骨髓细胞。每个骨使用0.5ml的α-MEM，并在6cm培养皿中临时收集细胞溶液（图1C）。
  注意：如果骨髓细胞不容易流出，用注射器针头短暂地在骨腔内搅动以调动细胞。
4. 轻轻吸取得到的细胞溶液，并将其通过40μm网孔细胞过滤器（图1D）过滤到15ml锥形管中。这一步是去除不需要的细胞簇和骨基质。通过在4℃下以400×g离心5分钟收集细胞并丢弃上清液。
5. 在200μl的α-MEM中重悬细胞沉淀并加入2ml稀释的红细胞裂解缓冲液。通过翻转试管轻轻混合溶液几次，然后在室温下放置5-10分钟，直到溶液变成透明红色（图1E）。
  注意：使用前准备好红细胞裂解缓冲液。红细胞裂解缓冲液以10x储备液供应。用去离子水稀释至工作浓度。
6. 通过在4℃下以400×g离心5分钟收集细胞。在这个阶段，细胞团应该几乎是白色的。如果不是，请重复步骤A5和A6。
7. 弃去上清液并将细胞重悬于10ml培养基中，并在37℃，5％CO 2细胞培养箱中于10cm培养皿中培养过夜。
  
  图1.破骨细胞生成测定概述A.解剖的股骨和胫骨; B.去除骨头; C.骨髓细胞的冲洗; D.通过细胞过滤器过滤; E.在（左），（中）和（右）红细胞溶解期间的原代骨髓细胞; F.成熟破骨细胞的代表性图像。比例尺= 50微米。
第1天：破骨细胞生成
1. 将悬浮的骨髓前体细胞收集在15ml锥形管中，并在4℃下以400gxg离心5分钟。
2. 在1ml培养基中重悬细胞团并通过血细胞计数器计数细胞数量。
  注意：在此步骤中，通常只需一只鼠标即可获得1-2 x 10元的电池。 />
3. 将消毒后的盖玻片放入24孔板的中心8个孔中。
  注意：每个设置通常需要重复4次。
4. 用培养基或培养基/条件培养基混合物稀释细胞溶液至浓度为1.6-2.0×10 6 / ml / ml。等分每个设置2ml细胞溶液（四次重复）。将M-CSF（终浓度25ng / ml）和RANKL（终浓度50ng / ml）原液添加至其最终浓度。
  注：rRANKL的最终浓度可能会有所不同，请参阅说明部分以获取指导。
  如果特定细胞因子或化学物质感兴趣，请将它们添加到细胞等分试样中。轻轻但彻底地吸取细胞溶液，并将500μl混合物转移到四次重复中的每一次。
第4天：使用与第1天相同的中等配方刷新媒体。
第7天：成熟破骨细胞的TRAP染色
1. 遵循制造商的协议（Sigma）进行盖玻片的染色步骤。这里是我们修改后的Sigma协议：
  注意：整个固定和染色过程可以在同一个破骨细胞分化的多孔板中进行。
  1. 通过混合25ml柠檬酸盐溶液（由染色试剂盒提供），65ml丙酮和8ml 37％甲醛来制备固定溶液。将固色剂溶液置于玻璃瓶中并盖紧。固定溶液在2-8°C时稳定2个月，如果观察到蒸发，则可丢弃。
  2. 预热足够的去离子水（每孔至少10ml）至整个测定的37℃，包括染色前后的洗涤。
  3. 将固定溶液带到室温（18-26°C）。吸出培养基并用PBS冲洗一次。通过添加500微升固定液/井固定细胞在盖玻片上30秒。
    在去离子水中彻底冲洗：不要让玻片干燥。
  4. 向1.5ml Eppendorf管中加入0.5ml快速石榴石GBC碱溶液和0.5ml亚硝酸钠溶液。轻轻倒转混合30秒。让它站立2分钟。
  5. 在“Beaker B”柱（预热至37℃的45ml去离子水，来自步骤D1d的1.0ml重氮化快速石榴石GBC溶液，0.5ml萘酚AS-BI磷酸盐溶液，2.0ml乙酸盐溶液和1.0ml酒石酸盐溶液）。
    注：除去离子水以外的所有溶液均由染色试剂盒提供。
  6. 每孔加入至少500μl染色溶液。将多孔板置于37°C培养箱中1小时，并保护板免受光照。
  7. 吸去染色液并用去离子水冲洗数次。小心取下盖子，然后风干。
2. 空气干燥的盖玻片的装载。
  1. 取一张干净的载玻片，并将一滴20μl中性香脂放在载玻片上。
  2. 小心地抓住边缘上的盖玻片，使细胞朝向载玻片朝向表面，并缓慢安装以避免气泡。
  3. 安装后一周内计算结果。成熟的破骨细胞是≥3个核且直径≥50μm的TRAP阳性细胞（图1F）。
  注：我们通常计数整个盖玻片TRAP阳性多核细胞收集数据。不建议通过随机快照收集数据，因为预先确定有多少快照足以估计破骨细胞的数量是非常困难的。

笔记

施用抗生素可能导致破骨细胞诱导失败，应避免使用。请使用无菌设备来处理鼠标组织和细胞。材料和试剂部分中提到的锥形管，注射器，培养皿，多孔板和细胞过滤器都是经过消毒的。其他工具，如提示，解剖镊子，剪刀和盖玻片可以高压灭菌。不能被高压灭菌的设备，如移液器，可以通过70％的乙醇喷雾灭菌。设备正确处理后，污染风险应该很低。
FBS的质量可能强烈影响破骨细胞的分化。而且，由于FBS的质量不同，rRANKL终浓度可以在0到100ng / ml之间变化，并且50ng / ml应该是适合的开始点。用户需要调整rRANKL的浓度，因为过多的rRANKL可以掩盖由用户感兴趣的特定试剂引起的调节。用户可以在中试中测试0到100ng / ml的一系列浓度。适当的浓度应该1）允许使用者观察具有正确形态的成熟破骨细胞和2）不使饱和破骨细胞形成，这意味着增加的rRANKL施用仍然可以诱导更多的破骨细胞。

食谱

培养基
含20％热灭活FBS的α-MEM
注意：通过在56℃孵育30分钟，可以将FBS热灭活。
磷酸盐缓冲盐水
1克NaCl
0.2克KCl
1.44克Na 2 HPO 4 4 0.24克KH 2 PO 4 4 用800ml去离子水稀释并用HCl调节至pH7.4 加入去离子水至1L的最终体积并高压灭菌该溶液。
鼠rRANKL和rM-CSF溶液
1. 将0.5 g BSA溶解在10 ml无菌PBS中并通过0.2μm过滤器过滤。
2. 在含有0.5％BSA溶液的PBS中重建冻干蛋白粉至终浓度为0.1mg / ml，轻轻搅动以确保其完全溶解。
3. 分装细胞因子溶液并储存在-80°C

致谢

本研究由国家自然科学基金（81430070,81661148048,81725017），中国科学院（QYZDB-SSW-SMC013，XDA12050101）和中国科学技术部（2017YFA0103502）资助。这项工作改编自以前的文献（Lu等人，2009; Wang等人，2014）。作者声明不存在利益冲突或利益冲突。

参考

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Lu，X.，Wang，Q.，Hu，G.，Van Poznak，C.，Fleisher，M.，Reiss，M.，Massague，J。和Kang，Y。（2009）。 ADAMTS1和MMP1通过蛋白水解方式使EGF样配体在骨溶解信号级联反应中发生骨转移。 Genes Dev 23（16）：1882-1894。
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Rodan，G.A。和Martin，T.J。（2000）。治疗骨疾病的方法 Science 289（5484 ）：1508-1514。
Suda，T.，Takahashi，N.，Udagawa，N.，Jimi，E.，Gillespie，M.T。和Martin，T.J。（1999）。肿瘤坏死因子受体和配体家族的新成员调节破骨细胞分化和功能< / a> Endocr Rev 20（3）：345-357。
Wang，Y.，Lei，R.，Zhuang，X.，Zhang，N.，Pan，H.，Li，G.，Hu，J.，Pan，X.，Tao，Q.，Fu，D.， Xiao，J.，Chin，YE，Kang，Y.，Yang，Q.和Hu，G。（2014）。 DLC1依赖性甲状旁腺激素样激素抑制抑制乳腺癌骨转移 J Clin Invest 124（4）：1646-1659。
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